Спираль матки: Установка внутриматочной спирали — цена, установить ВМС у гинеколога в «СМ-Клиника»

Анализ пролиферации клеток

Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo, CK04, Япония) использовали в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, 10 мкл раствора CCK-8 добавляли в каждую лунку для культивирования и после культивирования в течение 4 ч определяли оптическую плотность при 450 нм с помощью считывающего устройства для микропланшетов.

Рисунок 1

Динамическая трансформация SPA – VSMCs в процессе ремоделирования SPA в децидуальной оболочке беременных на ранних сроках. (A) Иммунофлуоресцентное окрашивание CD31 (зеленый) и CK7 (красный), αSMA (зеленый) в соседних срезах для идентификации различных стадий ремоделирования SPA. (B) Иммунофлуоресцентное окрашивание CD31 (зеленый) и CK7 (красный), αSMA (зеленый) и SM22α (красный), кальпонина (красный) в соседних срезах SPA на разных стадиях ремоделирования. Увеличение прямоугольных областей, показывающих закругленные, разделенные и смещенные SPA – VSMC.Розовые стрелки указывают закругленные SPA-VSMC, желтые стрелки указывают разделенные SPA-VSMC, а белые стрелки указывают смещенные SPA-VSMC. (C) Статистический анализ морфологически трансформированных SPA – VSMCs на разных стадиях ремоделирования. Левая панель представляет собой частоту разделенных SPA, а правая панель показывает долю округленных и смещенных SPA – VSMC. Статистический анализ выполняется на основе записи из пяти случаев для каждого этапа ремоделирования и трех случайных просмотров в каждом случае.Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение, сравнение между группами проводится с помощью критерия Стьюдента t . ^* P <0,05. Шкала показывает 100 мкм.

Рисунок 1

Динамическое преобразование SPA – VSMCs в процессе ремоделирования SPA в децидуальной оболочке беременных на ранних сроках. (A) Иммунофлуоресцентное окрашивание CD31 (зеленый) и CK7 (красный), αSMA (зеленый) в соседних срезах для идентификации различных стадий ремоделирования SPA. (B) Иммунофлуоресцентное окрашивание CD31 (зеленый) и CK7 (красный), αSMA (зеленый) и SM22α (красный), кальпонина (красный) в соседних срезах SPA на разных стадиях ремоделирования.Увеличение прямоугольных областей, показывающих закругленные, разделенные и смещенные SPA – VSMC. Розовые стрелки указывают закругленные SPA-VSMC, желтые стрелки указывают разделенные SPA-VSMC, а белые стрелки указывают смещенные SPA-VSMC. (C) Статистический анализ морфологически трансформированных SPA – VSMCs на разных стадиях ремоделирования. Левая панель представляет собой частоту разделенных SPA, а правая панель показывает долю округленных и смещенных SPA – VSMC. Статистический анализ выполняется на основе записи из пяти случаев для каждого этапа ремоделирования и трех случайных просмотров в каждом случае.Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение, сравнение между группами проводится с помощью критерия Стьюдента t . ^* P <0,05. Шкала показывает 100 мкм.

Иммунофлуоресценция – ДНК – ISH – PLA

Эксперимент проводился, как сообщалось ранее [19]. Вкратце, меченный биотином зонд MYh21 человека был получен с помощью системы маркировки ДНК BioNick (Thermo Fisher, 18247015, США). Последовательность праймера приведена в дополнительной таблице S1.Иммунофлуоресценцию для CK7, виментина, αSMA и CD56 проводили в парафиновом срезе децидуальных тканей, как описано выше, и срезы переваривали пепсином (ZSGB-BIO) при 37 ° C в течение 10 мин. Зонд MYh21 денатурировали в течение 5 мин при 80 ° C и наносили на срезы. Срезы инкубировали при 37 ° C в течение 16 ч с последующей промывкой буфером SSC и дальнейшей инкубацией с антителами против h4K4dime (05-1338, Millipore, RRID: AB_1977248) и биотина (Abcam, ab53494, RRID: AB_867860) в течение ночи при 4. ° C.PLA выполняли с использованием набора для обнаружения Duolink Orange и наблюдали при 555 нм (DUO

, DUO

Анализ ChIP

Выделенные EVT, DSC и dNK подвергали выделению хроматина с использованием набора Millipore EZ ChIP Kit (Millipore, 17-371, RRID: AB_1977248) в соответствии с инструкциями производителя.Вкратце, клетки были зафиксированы и сшиты 1% формальдегидом и остановлены раствором глицина. Затем клетки лизировали буфером для лизиса SDS и обрабатывали ультразвуком в течение 15 мин (9 с пробег и 30 с пауза на цикл) для получения фрагментов ДНК длиной 200–2000 п.н. Разрезанные фрагменты ДНК связывали с белком G агарозы в течение 1 часа и инкубировали с антителом h4K4dime (Millipore, 05-1338) при 4 ° C в течение ночи. После промывки использовали буфер для элюции и 5 M Nacl для высвобождения поперечной сшивки, а РНКазу A использовали для гидролиза загрязненной РНК. ДНК очищали и анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Последовательности праймеров перечислены в дополнительной таблице S1.

Проточная цитометрия

Для анализа чистоты клеток выделенные dNK, децидуальные макрофаги и EVT отдельно инкубировали со следующими антителами в течение 30 мин при 4 ° C: меченные APC анти-CD56 (BioLegend, 318310, RRID: AB_604106, San Diego CA, США), меченный FITC анти-CD14 (BioLegend, 367115, RRID: AB_2571928) и меченный PE анти-HLA-G (ebioscience, 12-9957-42, RRID: AB_11149313, Калифорния, США) и подвергали обработке цитометрический анализ.

Рисунок 2

Локализация DSC, dNK, децидуальных макрофагов и EVT на разных стадиях ремоделирования SPA. (A) Типичный результат иммуногистохимии для CK7, αSMA и виментина в ткани децидуальной оболочки с артериями Un-Rem на 5 неделе гестации. (B) Иммунофлуоресцентное окрашивание SM22α (зеленый), CD56 (белый) и CK7 (красный) во время СПА-ремоделирование децидуальной оболочки на ранних сроках беременности. Верхняя панель показывает Un-Rem SPA, а нижняя панель показывает реконструированную SPA. (C) Иммунофлуоресцентное окрашивание SM22α (зеленый), CD163 (белый) и CK7 (красный) во время ремоделирования SPA в децидуальной оболочке беременных на ранних сроках.Верхняя панель показывает Un-Rem SPA, а нижняя панель показывает реконструированную SPA. (D) Иммунофлуоресцентное окрашивание CK7 (красный) и SM22α (зеленый) во время ремоделирования SPA у децидуальной оболочки на ранних сроках беременности. Верхняя панель показывает Un-Rem SPA, а нижняя панель показывает реконструированную SPA. Стрелки указывают смещенные и разделенные SPA – VSMC. Шкала показывает 100 мкм.

Рисунок 2

Локализация DSC, dNK, децидуальных макрофагов и EVT на разных стадиях ремоделирования SPA. (A) Типичный результат иммуногистохимии для CK7, αSMA и виментина в ткани децидуальной оболочки с артериями Un-Rem на 5 неделе гестации.(B) Иммунофлуоресцентное окрашивание SM22α (зеленый), CD56 (белый) и CK7 (красный) во время ремоделирования SPA у децидуальной оболочки беременных на ранних сроках. Верхняя панель показывает Un-Rem SPA, а нижняя панель показывает реконструированную SPA. (C) Иммунофлуоресцентное окрашивание SM22α (зеленый), CD163 (белый) и CK7 (красный) во время ремоделирования SPA в децидуальной оболочке беременных на ранних сроках. Верхняя панель показывает Un-Rem SPA, а нижняя панель показывает реконструированную SPA. (D) Иммунофлуоресцентное окрашивание CK7 (красный) и SM22α (зеленый) во время ремоделирования SPA у децидуальной оболочки на ранних сроках беременности. Верхняя панель показывает Un-Rem SPA, а нижняя панель показывает реконструированную SPA.Стрелки указывают смещенные и разделенные SPA – VSMC. Шкала показывает 100 мкм.

Для клеточного апоптоза и анализа жизнеспособности клеток клетки T / G HA-VSMC, обработанные различными средами для кондиционирования или индуцированные 2 мкг / мл пуромицина, расщепляли 0,01% трипсином и подвергали воздействию аннексина V / PI (трансген, FA101 , Пекин, Китай) и 7-AAD (ebioscience, 420403) соответственно. Вкратце, для анализа аннексина V / PI к суспендированным клеткам добавляли аннексин V-FITC и PI в соотношении 1:20 и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре с последующим анализом проточной цитометрии в течение 1 часа. Для анализа 7-AAD к суспендированным клеткам добавляли 7-AAD в концентрации 0,25 мкг на миллион клеток и инкубировали при 4 ° C в течение 10 мин перед анализом проточной цитометрии. Анализ проточной цитометрии проводили с использованием CytoFLEX (Beckman Coulter, Inc.), а данные анализировали с помощью CytExpert (Beckman Coulter, Inc.).

Рисунок 3

DSC активно индуцируют дедифференцировку VSMC. (A, B) Относительные уровни мРНК (A) и уровни белка (B) αSMA, кальпонина, SM22α или MYh21 в T / G HA-VSMC, обработанных DSC-CTRL или DSC-CM ( n = 3) .(C) Иммунофлуоресцентное окрашивание αSMA в T / G HA-VSMC, обработанном DSC-CTRL или DSC-CM. Статистический анализ проводится по не менее чем трем независимо повторяющимся экспериментам. Белыми стрелками обозначены клетки круглой формы. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение, и сравнение между группами выполняется с помощью критерия Стьюдента t . ^* P <0,05. Шкала показывает 100 мкм.

Рисунок 3

DSC активно индуцируют дедифференцировку VSMC. (A, B) Относительные уровни мРНК (A) и уровни белка (B) αSMA, кальпонина, SM22α или MYh21 в T / G HA-VSMC, обработанных DSC-CTRL или DSC-CM ( n = 3) .(C) Иммунофлуоресцентное окрашивание αSMA в T / G HA-VSMC, обработанном DSC-CTRL или DSC-CM. Статистический анализ проводится по не менее чем трем независимо повторяющимся экспериментам. Белыми стрелками обозначены клетки круглой формы. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение, и сравнение между группами выполняется с помощью критерия Стьюдента t . ^* P <0,05. Шкала показывает 100 мкм.

Статистический анализ

Статистические анализы были выполнены с помощью GraphPad Prism (Сан-Диего, Калифорния, США) и представлены как среднее ± стандартное отклонение.Статистическое сравнение между группами выполняли с помощью независимого теста t или множественного сравнительного анализа с помощью теста Тьюки-Крамера в соответствии с по меньшей мере тремя независимо повторяемыми экспериментами. Значение P менее 0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Характеристики SPA – VSMC на разных этапах ремоделирования SPA человека

Децидуальные базальные клетки человека на 6–12 неделях гестации подвергали иммунофлуоресцентному анализу на CK7, CD31 и αSMA в соседних срезах, которые маркируют EVT, эндотелиальные клетки и VSMC соответственно.Основываясь на паттерне распределения этих клеток, SPA могут быть идентифицированы как Un-Rem, стадии раннего ремоделирования (Early-Rem), активного ремоделирования (Act-Rem) и стадии Fully-Rem (Figure 1A). Иммунное окрашивание на три традиционных маркера VSMC, αSMA, SM22α и кальпонин, было дополнительно выполнено для изучения морфологического изменения SPA – VSMC на этих стадиях ремоделирования SPA (рис. 1B). Интересно, что морфологические изменения SPA – VSMC, включая смещение и / или округлую форму, можно было обнаружить в Un-Rem SPA, хотя и с относительно низкой частотой. На стадии Early-Rem инвазивные EVT собирались вокруг SPA, и небольшое количество EVT можно было обнаружить на стенке сосуда. Многослойные VSMC вокруг этих SPA казались сильно ослабленными и разделенными, а многие VSMC выглядели значительно смещенными и / или круглыми. На стадии Act-Rem EVT в значительной степени заменяли эндотелий в SPA, в то время как количество VSMC было заметно уменьшено. В сосудах Fully-Rem окрашивание на αSMA, SM22α и кальпонин было неизменно неопределяемым (рис. 1B).Чтобы количественно оценить морфологические изменения SPA-VSMC, мы статистически проанализировали по крайней мере пять случаев для каждой стадии ремоделирования и записали три случайных изображения в каждом случае, чтобы подсчитать процент сосудов с разделенными слоями гладких мышц и VSMC с смещением и круглой формой. Как показано на Рисунке 1C, частота сосудов с разделением слоев и соотношение трансформированных VSMC были значительно выше на стадиях ремоделирования по сравнению со стадией Un-Rem, а изменения в артерии Act-Rem были более очевидными, чем в артерии Early-Rem. (Рисунок 1С).

Взятые вместе, эти данные наблюдений четко иллюстрировали динамическую трансформацию SPA – VSMCs в процессе ремоделирования SPA.

Децидуальные СК индуцировали дедифференцировку VSMC

Результаты нашего гистологического исследования процесса ремоделирования сосудов матки подтверждают наличие трансформации VSMC до инвазии трофобластов. Литературные данные продемонстрировали, что SPA – VSMCs не проявляют трансформации в небеременном эндометрии [4, 20].При эмбриональной имплантации клетки стромы эндометрия претерпевают ярко выраженную децидуализацию, которая продуцирует множество цитокинов, хемокинов и гормонов и привлекает лимфоциты [21, 22]. Наш иммуногистохимический анализ на αSMA, виментин (маркировка эндометриальных SCs) и CK7 в соседних участках децидуальной основы человека на ранних сроках беременности выявил очень близкую локализацию DSC с смещенными SPA – VSMC вокруг артерий Un-Rem (рис. 2A). Таким образом, мы предположили, что клетки децидуальной стромы могут индуцировать трансформацию VSMCs на EVT-независимой стадии.

Рисунок 4

Децидуальные NK способствуют дедифференцировке VSMC. (A, B) Относительные уровни мРНК (A) и уровни белка (B) αSMA, кальпонина, SM22α или MYh21 в T / G HA-VSMC, обработанных dNK-CTRL и dNK-CM ( n = 3 ). (C) Клеточное иммунофлуоресцентное окрашивание αSMA для совместных культур T / G HA-VSMC с dNK-CTRL и dNK-CM. Белыми стрелками обозначены клетки круглой формы. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение, и сравнение между группами выполняется с помощью теста Стьюдента t . ^* P <0,05. Шкала показывает 100 мкм.

Рисунок 4

Децидуальные NK способствуют дедифференцировке VSMC. (A, B) Относительные уровни мРНК (A) и уровни белка (B) αSMA, кальпонина, SM22α или MYh21 в T / G HA-VSMC, обработанных dNK-CTRL и dNK-CM ( n = 3 ). (C) Клеточное иммунофлуоресцентное окрашивание αSMA для совместных культур T / G HA-VSMC с dNK-CTRL и dNK-CM. Белыми стрелками обозначены клетки круглой формы. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение, и сравнение между группами выполняется с помощью теста Стьюдента t . ^* P <0,05. Шкала показывает 100 мкм.

Рисунок 5

Децидуальные макрофаги способствуют дедифференцировке VSMC. (A, B) Относительные уровни мРНК (A) и уровни белка (B) αSMA, кальпонина, SM22α или MYh21 в T / G HA-VSMC, обработанных dM-CTRL и dM-CM ( n = 3 ). (C) Клеточное иммунофлуоресцентное окрашивание αSMA для совместных культур T / G HA-VSMC с dM-CTRL и dM-CM. Белыми стрелками обозначены клетки круглой формы. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение, и сравнение между группами выполняется с помощью критерия Стьюдента t . ^* P <0,05. Шкала показывает 100 мкм.

Рисунок 5

Децидуальные макрофаги способствуют дедифференцировке VSMC. (A, B) Относительные уровни мРНК (A) и уровни белка (B) αSMA, кальпонина, SM22α или MYh21 в T / G HA-VSMC, обработанных dM-CTRL и dM-CM ( n = 3 ). (C) Клеточное иммунофлуоресцентное окрашивание αSMA для совместных культур T / G HA-VSMC с dM-CTRL и dM-CM. Белыми стрелками обозначены клетки круглой формы. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение, и сравнение между группами выполняется с помощью критерия Стьюдента t . ^* P <0,05. Шкала показывает 100 мкм.

Для измерения дедифференцировки VSMC в качестве модели in vitro использовали клеточную линию VSMC аорты человека, T / G HA-VSMC. Мы ферментативно выделили первичные DSC человека на ранних сроках беременности (дополнительный рисунок S1A) и собрали среду для условий после 48 часов культивирования (DSC-CM). Культуральные среды без DSC собирали параллельно в качестве контроля (DSC-CTRL). Клетки T / G HA-VSMC подвергали 3-дневной обработке DSC-CM или DSC-CTRL при 50% концентрации и измеряли экспрессию маркеров для SMC.Результаты ПЦР в реальном времени (рис. 3A) и вестерн-блоттинга (рис. 3B) показали, что уровни транскрипции и уровни белка αSMA, SM22α, кальпонина и MYh21 были значительно снижены в DSC-CM-обработанных клетках по сравнению с таковыми в клетках, обработанных DSC-CM. контрольные клетки, обработанные DSC-CTRL. Параллельно иммунофлуоресценция для αSMA показала очевидное уменьшение положительного сигнала αSMA и увеличение количества круглых клеток (рис. 3C).

Для оценки потенциального влияния лечения на жизнеспособность клеток, пролиферацию и апоптоз клеток анализировали в клетках T / G HA-VSMC после 3-дневной инкубации с кондиционирующей средой.Результат анализа CCK8 показал отсутствие изменений в росте клеток после обработки DSC-CM (дополнительная фигура S1E). Результаты проточной цитометрии для аннексина V / PI и 7-AAD, а также вестерн-блоттинга для расщепленной каспазы 3 продемонстрировали небольшую апоптотическую функцию в клетках T / G HA-VSMC, обработанных DSC-CTRL или DSC-CM, в то время как апоптоз в большом количестве наблюдался. сигналы в положительных контрольных клетках, которые были индуцированы пуромицином 2 мкг / мл (дополнительная фигура S2). Данные показали, что обработка DSC-CM в T / G HA-VSMC не влияла на жизнеспособность клеток.

Децидуальные NK-клетки и макрофаги способствовали дедифференцировке VSMC

Рекрутмент массивных лимфоцитов в децидуальную оболочку — критическое событие на ранних сроках беременности. Среди децидуальных лимфоцитов на ранних сроках беременности dNK и макрофаги составляют примерно 70 и 20% соответственно [23-25]. Эти клетки играют множество ролей, в том числе способствуют ремоделированию SPA, способствуют инвазии трофобластов и росту плода, регулируют дифференцировку других иммунных клеток и так далее [26–28].В образцах decidual basalis наш иммунофлуоресцентный анализ для SM22α, CD56 / CD163 и CK7 показал, что dNKs и макрофаги локализованы близко к трансформированным SPA – VSMC как на стадии Un-Rem, так и на стадии ремоделирования (рис. 2B и C). Эти лимфоциты потенциально могут способствовать дедифференцировке SPA – VSMC.

Таким образом, мы изолировали первичные dNK и децидуальные макрофаги из тканей децидуальной оболочки человека на ранних сроках беременности с помощью магнитных шариков, специфичных для CD56 или CD14. Проточная цитометрия показала, что их чистота была более 90% (дополнительные рисунки S1B и C).Среды для кондиционирования dNK или децидуальных макрофагов собирали отдельно через 24 часа культивирования (dNK-CM и dM-CM) и использовали при 50% концентрации для обработки клеток T / G HA-VSMC в течение 3 дней. Как и ожидалось, уровни маркеров VSMC, αSMA, кальпонина, SM22α и MYh21 в клетках T / G HA-VSMC заметно снижались при обработке dNK-CM или dM-CM (Фигуры 4A и B и 5A и B). . Соответственно, изменение морфологии клеток до округлой формы и значительное уменьшение окрашивания αSMA в T / G HA-VSMC клетках, обработанных dNK-CM или dM-CM, были выявлены с помощью иммунофлуоресценции для αSMA (Фигуры 4C и 5C).Данные доказали активную функцию dNKs и децидуальных макрофагов, способствующих дедифференцировке VSMC.

Как указано выше, результаты анализа CCK8 (дополнительный рисунок S1E), проточной цитометрии для аннексина / PI и 7-AAD (дополнительный рисунок S2A и B) и вестерн-блоттинга для расщепленной каспазы 3 (дополнительный рисунок S2C) продемонстрировали, что лечение dNK -CM или dM-CM в T / G HA-VSMC не влияли на жизнеспособность клеток.

EVT улучшенная дедифференциация VSMC

Близкая локализация EVTs с SPA – VSMCs на стадии ремоделирования была хорошо известна, и здесь наши результаты иммунофлуоресценции при ремоделировании SPA подтвердили проявление (Figure 2D).В литературных исследованиях, посвященных влиянию клеток трофобласта на дедифференцировку SPA – VSMC, в качестве модели клеток обычно использовались ворсинчатые трофобласты [29, 30]. В то время как особенности ворсинчатых трофобластов сильно отличаются от децидуальных EVT. После этого мы отсортировали EVT в децидуальной оболочке на ранних сроках беременности с помощью магнитных шариков на HLA-G, который является специфическим маркером EVT. Проточная цитометрия показала, что чистота клеток составляла около 94% (дополнительный рисунок S1D). Клетки T / G HA-VSMC обрабатывали 50% кондиционной средой EVT (EVT-CM) в течение 3 дней.Неудивительно, что экспрессия αSMA, кальпонина, SM22α и MYh21 была явно подавлена ​​обработкой (фиг. 6A и B), а фенотипы дедифференцировки были выявлены при иммуноокрашивании на αSMA (фиг. 6C).

Рисунок 6

Децидуальные EVT способствуют дедифференцировке VSMC. (A, B) Относительные уровни мРНК (A) и уровни белка (B) αSMA, кальпонина, SM22α или MYh21 в T / G, обработанных HA-VSMC с EVT-CTRL и EVT-CM ( n = 3 ).(C) Клеточное иммунофлуоресцентное окрашивание αSMA для совместных культур T / G HA-VSMC с EVT-CTRL и EVT-CM. Белыми стрелками обозначены клетки круглой формы. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение, и сравнение между группами выполняется с помощью критерия Стьюдента t . ^* P <0,05. Шкала показывает 100 мкм.

Рисунок 6

Децидуальные EVT способствуют дедифференцировке VSMC. (A, B) Относительные уровни мРНК (A) и уровни белка (B) αSMA, кальпонина, SM22α или MYh21 в T / G, обработанных HA-VSMC с EVT-CTRL и EVT-CM ( n = 3 ).(C) Клеточное иммунофлуоресцентное окрашивание αSMA для совместных культур T / G HA-VSMC с EVT-CTRL и EVT-CM. Белыми стрелками обозначены клетки круглой формы. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение, и сравнение между группами выполняется с помощью критерия Стьюдента t . ^* P <0,05. Шкала показывает 100 мкм.

Опять же, результаты анализа CCK8 (дополнительный рисунок S1E), проточной цитометрии для аннексина / PI и 7-AAD (дополнительный рисунок S2A и B) и вестерн-блоттинга для расщепленной каспазы 3 (дополнительный рисунок S2C) продемонстрировали, что лечение EVT- CM не влиял на жизнеспособность клеток в T / G HA-VSMC.

SPA – VSMC потенциально могут дедифференцироваться по отношению к dNK

Теперь, когда наши результаты подтвердили, что различные типы клеток в децидуальной оболочке участвуют в регуляции дедифференцировки SPA-VSMC, остается вопрос, где эти дедифференцированные клетки находятся. Примечательно, что тщательное исследование иммунофлуоресцентного окрашивания выявило наличие двойных положительных клеток SM22α и CD56, составляющих примерно 2% VSMC в области, близкой к ремоделирующимся SPA (рис. 7A), что указывает на то, что эти клетки могут обладать характеристиками как VSMC, так и dNKs.

Рисунок 7

SPA – VSMC потенциально дедифференцируются по отношению к dNK во время ремоделирования SPA. (A) Иммунофлуоресцентное окрашивание на SM22α (зеленый), CD56 (белый) и CK7 (красный) в децидуальной оболочке на ранних сроках беременности показывает наличие двойных положительных клеток SM22α и CD56 (стрелка). (B) Иммунофлуоресцентный анализ ДНК – ISH – PLA в децидуальной оболочке человека на ранних сроках беременности. Левая верхняя панель показывает типичный сигнал PLA (красный, стрелка) в VSMC, помеченных αSMA (зеленый). Правая верхняя панель показывает сигнал PLA (красный, стрелка) в отдельных dNK, который отмечен CD56 (зеленый).Левая нижняя панель показывает несколько сигналов PLA (красный) в EVT, которые помечены CK7 (зеленый). Правая нижняя панель показывает несколько сигналов PLA (красный) в DSC, которые помечены Vimentin (зеленый). (C) Статистические результаты анализа ChIP в CD56 ⁺ dNK, показывающие обогащение h4K4dime в промоторной области гена MYh21 . Статистические результаты анализа ChIP в EVT и DSC в качестве отрицательного контроля показывают меньшее обогащение h4K4dime в промоторной области гена MYh21 . Статистический анализ проводится по не менее чем трем независимо повторяющимся экспериментам.Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение, и сравнение между группами выполняется с помощью критерия Стьюдента t . ^* P <0,05. Шкала показывает 100 мкм.

Рисунок 7

SPA – VSMC потенциально дедифференцируются в сторону dNK во время ремоделирования SPA. (A) Иммунофлуоресцентное окрашивание на SM22α (зеленый), CD56 (белый) и CK7 (красный) в децидуальной оболочке на ранних сроках беременности показывает наличие двойных положительных клеток SM22α и CD56 (стрелка). (B) Иммунофлуоресцентный анализ ДНК – ISH – PLA в децидуальной оболочке человека на ранних сроках беременности.Левая верхняя панель показывает типичный сигнал PLA (красный, стрелка) в VSMC, помеченных αSMA (зеленый). Правая верхняя панель показывает сигнал PLA (красный, стрелка) в отдельных dNK, который отмечен CD56 (зеленый). Левая нижняя панель показывает несколько сигналов PLA (красный) в EVT, которые помечены CK7 (зеленый). Правая нижняя панель показывает несколько сигналов PLA (красный) в DSC, которые помечены Vimentin (зеленый). (C) Статистические результаты анализа ChIP в CD56 ⁺ dNK, показывающие обогащение h4K4dime в промоторной области гена MYh21 .Статистические результаты анализа ChIP в EVT и DSC в качестве отрицательного контроля показывают меньшее обогащение h4K4dime в промоторной области гена MYh21 . Статистический анализ проводится по не менее чем трем независимо повторяющимся экспериментам. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение, и сравнение между группами выполняется с помощью критерия Стьюдента t . ^* P <0,05. Шкала показывает 100 мкм.

Сообщалось, что VSMC специфически проявляют модификацию h4K4dime на промоторе гена MYh21 [19, 31], что может быть обнаружено с помощью анализа IF-ISH-PLA [19].Этот метод идентифицирует h4K4dime в промоторе MYh21 по сигналу PLA в отдельной клетке, которая помечена иммунофлуоресценцией для определенного клеточного маркера. Используя этот метод, мы обнаружили в децидуальной ткани человека примерно 5% клеток CD56 ⁺ dNK отображали положительный сигнал для PLA, который обычно обнаруживался в αSMA-положительных SPA – VSMC (рис. 7B). Однако ни EVT, меченные СК, ни ДСК, меченные виментином, не показали никакого сигнала PLA (рис. 7B). Данные показали, что небольшое количество клеток CD56 ⁺ dNK специфически проявляет модификацию h4K4dime в промоторной области MYh21 .

Для подтверждения результатов первичные dNK, EVT и DSC, очищенные из децидуальной оболочки человека на ранних сроках беременности (дополнительный рисунок S1), подвергали анализу ChIP. Результаты выявили очевидную модификацию h4K4dime в промоторной области MYh21 в dNK, но не в EVT или DSC (фиг. 7C). Взятые вместе, эти результаты подтверждают, что часть SPA-VSMCs может дедифференцироваться в сторону dNKs во время ремоделирования SPA.

Обсуждение

Успех беременности регулируется сложным взаимодействием клеток на границе раздела матери и плода, и многие клетки динамически изменяли свои характеристики и функции, чтобы удовлетворить потребность в росте плода.Физиологические изменения SPA – VSMCs во время ремоделирования SPA отражают сложные перекрестные помехи между множественными типами клеток. Обобщая данные этого исследования и литературные данные, можно сказать, что процесс дедифференцировки SPA-VSMCs проиллюстрирован на рисунке 8. В небеременной матке очень мало лимфоцитов существует в эндометрии [32, 33], а SPA эндометрия имеют интактный слой VSMC в какие SPA – VSMC представляют типичную функцию SMC [4, 20] (рисунок 8A). С физиологической точки зрения децидуализация эндометрия матки является преобладающим процессом подготовки эндометрия к беременности.У человека процесс децидуализации запускается в середине секреторной фазы менструального цикла и широко проявляется во время беременности [34, 35]. Важно отметить, что децидуализация происходит сначала вокруг терминальных СПА поверхностного слоя эндометрия, и в конечном итоге она затрагивает весь эндометрий во время беременности. Хорошо известно, что активация пути цАМФ, который может повышать чувствительность эндометриальных клеток человека к прогестерону, является начальным и обязательным событием, запускающим децидуальный процесс [36].После эмбриональной имплантации огромное количество полученного из трофобласта человеческого хорионического гонадотропина (ХГЧ) передает сигнал через путь цАМФ, преимущественно ускоряя процесс децидуализации [37]. DSC активны в производстве большого количества цитокинов и хемокинов, которые имеют решающее значение для регистрации и модуляции лимфоцитов и, таким образом, для защиты генетически «чужеродного» полуаллогенного эмбриона. Морфологические изменения SPA-VSMC в артериях Un-Rem и заметные изменения в клеточных свойствах VSMC при обработке условной средой из DSC, dNK или децидуальных макрофагов указывают на первичную роль DSC в инициации дедифференцировки SPA-VSMC, которая впоследствии усиливается этими лимфоцитами перед участием EVT (рис. 8B и C).Драматическая дедифференцировка SPA-VSMCs происходит после вторжения EVTs, в конечном итоге приводя к исчезновению VSMCs на стадии Fully-Rem (Рис. 8D и E). При доношенной беременности, когда полные SPA были реконструированы, EVT в диком виде существовали вокруг и внутри SPA, а SPA – VSMC почти полностью исчезли (дополнительный рисунок S3). Каскадная регуляция дедифференцировки SPA-VSMC отражает гармонизированные взаимодействия между множественными типами клеток в децидуальном компартменте.

Рисунок 8

Схематический рисунок, иллюстрирующий постепенное преобразование SPA – VSMC во время ремоделирования SPA.(A) На небеременной стадии SPA – VSMC эндометрия остаются неизменными в менструальном цикле, и небольшое количество dNK и децидуальных макрофагов существует в эндометрии. (B) Стромальные клетки эндометрия подвергаются децидуализации при имплантации эмбриона, и они инициируют морфологическую трансформацию SPA – VSMCs. (C) Децидуальные NKs и децидуальные макрофаги рекрутируются в децидуальный компартмент, и они усиливают разделение, смещение и округление SPA – VSMCs на стадии Un-Rem. (D) Экстраворсинчатые трофобласты вторгаются и работают вместе с dNKs и децидуальными макрофагами, чтобы вызвать заметную дедифференцировку SPA-VSMCs на стадии ремоделирования.Обратите внимание на появление клеток с двойной функцией VSMC и dNKs, окружающих ремоделирующуюся SPA (розовые клетки). (E) VSMC спиральной артерии исчезают на стадии Fully-Rem.

Рисунок 8

Схематический рисунок, иллюстрирующий постепенное преобразование SPA – VSMC во время ремоделирования SPA. (A) На небеременной стадии SPA – VSMC эндометрия остаются неизменными в менструальном цикле, и небольшое количество dNK и децидуальных макрофагов существует в эндометрии. (B) Стромальные клетки эндометрия подвергаются децидуализации при имплантации эмбриона, и они инициируют морфологическую трансформацию SPA – VSMCs.(C) Децидуальные NKs и децидуальные макрофаги рекрутируются в децидуальный компартмент, и они усиливают разделение, смещение и округление SPA – VSMCs на стадии Un-Rem. (D) Экстраворсинчатые трофобласты вторгаются и работают вместе с dNKs и децидуальными макрофагами, чтобы вызвать заметную дедифференцировку SPA-VSMCs на стадии ремоделирования. Обратите внимание на появление клеток с двойной функцией VSMC и dNKs, окружающих ремоделирующуюся SPA (розовые клетки). (E) VSMC спиральной артерии исчезают на стадии Fully-Rem.

Ремоделирование SPA перед инвазией клеток трофобласта является предпосылкой для следующего ремоделирования EVT маточных артерий. Раннее исследование гистерэктомии показало, что клетки трофобласта не могут проникать в стенку маточного SPA на небеременной стадии, но они могут это сделать в образцах матки, взятых с помощью кесарева сечения при доношенной беременности [38]. Безусловно, многие исследования выяснили действие лимфоцитов матки, в первую очередь dNKs и макрофагов, в индукции трансформации или дедифференцировки VSMC матки [8, 39, 40].В этом пункте мы сообщили о результатах, аналогичных предыдущим исследованиям. Однако остается неизвестным, участвуют ли и каким образом децидуальные клетки стромы в этом процессе. Недавний одноклеточный анализ взаимодействия матери и плода человека на ранних сроках беременности аннотировал молекулярные особенности трех подмножеств ДСК, а анализ взаимодействия лиганд-рецептор позволил предположить потенциальное перекрестное взаимодействие подмножеств SC в компактной децидуальной оболочке с периваскулярными SMC через IGF-IGF1R , Распознавание VEGF-KDR / NRP1 [41]. Кроме того, исследования артерий из других тканей показали, что PDGF-BB играет критическую роль в обеспечении дедифференцировки VSMC посредством передачи сигналов Erk [42].О продукции PDGF с помощью DSC сообщалось в нескольких исследованиях [43–45]. Эти доказательства, вместе с тем фактом, что маточные артерии анатомически встроены в строму, указывают на способность DSCs вызывать начальный сигнал, индуцирующий дедифференцировку SPA-VSMCs. Действительно, наши данные in vitro о клетках VSMC предоставляют убедительные доказательства такой функции DSC, хотя рабочие факторы еще предстоит идентифицировать.

События децидуализации стромы, инфильтрации лимфоцитов, инвазии EVT и замещения эндотелия происходят по очереди во время беременности.Анализ одноклеточного секвенирования децидуальной оболочки человека обеспечивает надежные молекулярные доказательства сложного взаимодействия между DSC, иммунными клетками, EVT, эндотелиальными клетками и периваскулярными SMC [41]. Накапливающиеся доказательства показывают, что большое количество иммунных клеток рекрутируется одновременно с децидуализацией [46], и множественные децидуальные хемокины, такие как CXCL6 и CCL14, имеют решающее значение для накопления dNKs и макрофагов в области, окружающей SPA [13]. Привлеченные иммунные клетки работают вместе с децидуальными клетками, направляя инвазию трофобластов и ремоделируя артерии [26, 47].С другой стороны, инвазивные EVT играют ключевую роль в снижении иммунно-атакующих свойств лимфоцитов [48]. Важно отметить, что активная интермодуляция между различными иммунными клетками гарантирует смещенную иммунно-защитную среду в децидуальной оболочке. В сложном децидуальном компартменте MMP9, ангиопоэтин (Ang) -1, Ang-2, интерферон-g, VEGF-C из клеток dNK [40, 9], IP-10 и CXCL10 из EVT [49] и фагоцитотическая функция Макрофаги [40], как было показано, в значительной степени нарушают целостность VSMC и ингибируют экспрессию маркерного гена VSMC [49].Помимо этих факторов, плацента активно продуцирует многочисленные miRNAs, которые, как было доказано, участвуют в модуляции различных клеточных событий, включая инвазию клеток трофобласта и ремоделирование SPA [50, 51]. Напр., Происходящий из плаценты miR-210 может нацеливаться на Efna3 и Bcl2, которые участвуют в ангиогенезе и трансформации VSMCs [52–55]. Кроме того, ряд исследований демонстрирует, что VSMC и эндотелий SPA экспрессируют хемокины, включая CCL4, 14, 16, 21, 22, CXCL12 и CX3CR1 [7, 13, 56-59], которые могут специфически привлекать макрофаги и NK и регулируют вторжение трофобластов.Следовательно, сложная регуляторная сеть среди DSC, децидуальных лейкоцитов, EVT, VSMC и эндотелия может определять успех ремоделирования сосудов. Сложность микросреды также отражена в наблюдении, что децидуальные СПА демонстрируют несинхронизированные фенотипические изменения на ранних сроках беременности. Состав типов клеток вокруг отдельных SPA варьируется, и дедифференцировка VSMC кажется более интенсивной в SPA, окруженной как EVT, так и иммунными клетками, по сравнению с этим SPA без EVT.Следовательно, стоит продолжить изучение того, как множественные клетки взаимодействуют пространственно-временным динамическим и гармонизированным образом, чтобы регулировать дедифференцировку SPA-VSMC.

На сегодняшний день судьба дедифференцированных SPA – VSMC остается загадкой. Наше исследование предоставляет первые доказательства потенциальной трансформации SPA – VSMC в CD56 ⁺ dNK. Модификация h4K4dime в промоторной области MYh21 в небольшой части dNK указывает на их происхождение от VSMC. Те клетки, окружающие ремоделирующие артерии с коэкспрессией SM22 и CD56, могут быть SPA-VSMCs, которые дедифференцируются в сторону dNK.Это открытие представляет особый интерес для изучения особого происхождения клеток dNK. Делеция T-bet и Nfil3, двух важных факторов транскрипции, управляющих развитием NK-клеток у мышей, серьезно снижает функциональные NK-клетки в других органах, но мало влияет на обогащение NK матки во время беременности [60–62]. Поэтому считается, что NK-клетки матки могут иметь различное происхождение. Здесь наши данные предполагают, что небольшая часть dNK потенциально происходит от VSMC.Пластичность SMCs была признана, и они могут дедифференцироваться до макрофагов, остеохондроцитов или адипоцитов при различных патологических состояниях [63–65]. Доказательства из модели мыши с отслеживанием клонов окончательно показали критическую роль KLF4 в регуляции фенотипических переходов SMCs [65]. Интересно, что исследования в матке демонстрируют участие KLF4 в регуляции рецептивности матки, что проявляется в стимуляции репликации эпителиальной ДНК с помощью эстроген-индуцированного KLF4, в то время как существует ингибирование этого процесса с помощью индуцированного прогестероном KLF15 [66].Хорошо известно, что маточные СПА чувствительны к стероидам [67–71]. Следовательно, наиболее вероятно, что гормоны беременных, эстроген и прогестерон, могут индуцировать факторы транскрипции, включая KLF4 и KLF15, в SPA-VSMC и регулировать трансформацию этих клеток в dNKs или другие типы клеток. С другой стороны, трансформация SPA-VSMCs в dNK также указывает на прямой механизм дедифференцировки VSMC во время ремоделирования сосудов матки. Основные механизмы требуют дальнейшего изучения.

Хотя мы наблюдали значительное снижение экспрессии маркерного гена VSMC и морфологические изменения в T / G HA-VSMC, которые обрабатывались кондиционирующей средой из различных децидуальных клеток, мы не обнаружили индукции маркеров dNK (дополнительный рисунок S4). Наиболее вероятно, что клетки T / G HA-VSMC не обладают реальными характеристиками SPA-VSMC. Свойства VSMC из разных органов или из разных сред различны [72, 73]. Модели in vitro, такие как совместное культивирование эксплантата плаценты и децидуальной оболочки, совместное культивирование EVTs-эндотелиальных клеток и VSMCs или культура хорионической пластинчатой ​​артерии (CPA), были использованы для изучения механизмов ремоделирования сосудов матки человека.Несомненно, что первичные SPA – VSMC из эндометрия человека на небеременной стадии или на ранних сроках беременности будут оптимальной моделью in vitro. Однако получить образцы SPA относительно сложно из-за их довольно небольшого размера (дополнительный рисунок S5). Улучшение методологии будет необходимо для получения достаточного количества SPA – VSMC для дальнейшего изучения механизма. Другой проблемой является создание оптимизированных условий индукции, имитирующих микросреду вокруг SPA – VSMC. Подходящая комбинация кондиционированных сред или факторов из разных типов децидуальных клеток может работать более эффективно, чтобы вызвать дедифференцировку VSMC.Однако это критически зависит от всестороннего определения факторов из различных типов клеток в нише децидуальной SPA в разных точках беременности.

В целом, наши данные указывают на сигнальный каскад от DSCs, dNKs, децидуальных макрофагов и EVTs, чтобы вызвать прогрессивную дедифференцировку маточных SPA – VSMCs и выявить потенциальную трансформацию SPA – VSMC в dNKs. Полученные данные расширяют наше понимание неотъемлемых ролей децидуальной ниши, которые контролируют дедифференцировку SPA – VSMC.Углубленное исследование основных механизмов может помочь в разработке новых стратегий предотвращения неблагоприятных исходов беременности, связанных с неудачами ремоделирования сосудов, такими как преэклампсия и выкидыш.

Благодарность

Благодарим за техническую поддержку г-жи Шивен Ли, Сили Чжу и Ся Ян в экспериментах по конфокальному анализу и анализу проточной цитометрии.

Конфликт интересов

Авторы заявили об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов

Ю.М. провели эксперименты, интерпретировали данные и составили рукопись. X.Y. и Л.З. собрали клинические образцы, подготовили разделы и интерпретировали данные. J.L. X.S. и Y.-x.L. помог в сборе образцов и культивировании клеток. Y.L.W. разработал и контролировал исследование, интерпретировал данные и редактировал рукопись.

Список литературы

Королевство

JC

Kaufmann

P

Кислород и развитие сосудов плаценты

Adv Exp Med Biol

1999

474

259

275

Плеть

GE

Эрнеруд

J

Децидуальные цитокины и осложнения беременности: внимание к самопроизвольному выкидышу

J Репрод Иммунол

2015

108

83

89

Burton

GJ

Jauniaux

E

Патофизиология ограничения роста плода из-за плаценты

Am J Obstet Gynecol

2018

218

S745

S761

Pijnenborg

R

Vercruysse

L

Hanssens

M

Спиральные артерии матки при беременности человека: факты и противоречия

Плацента

2006

27

939

958

Harris

LK

Keogh

RJ

Wareing

M

Baker

PN

Cartwright

JE

000

GS5000 Whitley

Инвазивные трофобласты стимулируют апоптоз гладкомышечных клеток сосудов с помощью fas-лиганд-зависимого механизма

Am J Pathol

2006

169

1863

1874

Keogh

RJ

Harris

LK

Freeman

A

Baker

PN

Aplin

JD

Трофобласты плода используют лиганд, индуцирующий апоптоз, связанный с апоптотическим цитокином фактора некроза опухоли альфа, для индукции гибели гладкомышечных клеток

Circ Res

2007

100

834

841

Smith

SD

Dunk

CE

Aplin

JD

Harris

LK

Jones

RL

Доказательства участия иммунных клеток в ремоделировании децидуальной спиральной артериолы на ранних сроках беременности человека

Am J Pathol

2009

174

1959

1971

Bulmer

JN

Innes

BA

Levey

J

Robson

SC

Lash

GE

Роль апоптоза и миграции клеток гладких мышц сосудов во время ремоделирования маточной спиральной артерии при нормальной беременности человека

FASEB J

2012

26

2975

2985

Robson

A

Harris

LK

Innes

BA

Lash

GE

Aljunaidy

MM

Aplin

Робсон

SC

Bulmer

JN

Естественные клетки-киллеры матки инициируют ремоделирование спиральной артерии при беременности человека

FASEB J

2012

26

4876

4885

Gomez

D

Owens

GK

Фенотипическое переключение гладкомышечных клеток при атеросклерозе

Cardiovasc Res

2012

95

156

164

Misra

A

Sheikh

AQ

Kumar

A

Luo

J

Zhang

J

Каплан

P

Городской

Z

Qyang

Y

Tellides

G

Greif

DM

Ингибирование интегрина бета3 — терапевтическая стратегия надклапанного стеноза аорты

J Exp Med

2016

213

451

463

Zhu

H

Hou

CC

Luo

LF

Hu

YJ

Yang

WX

Стромальные клетки эндометрия и децидуализированные стромальные клетки: происхождение, трансформация и функции

Gene

2014

551

1

14

Choudhury

RH

Dunk

CE

Lye

SJ

Aplin

JD

Harris

LK

Jones

Взаимное взаимодействие вневорсинчатых трофобластов и эндотелиальных клеток опосредует инфильтрацию лейкоцитов для раннего ремоделирования стенки децидуальной спиральной артериолы

J Immunol

2017

198

4115

4128

Faas

MM

de

Vos

P

NK-клетки и макрофаги матки при беременности

Плацента

2017

56

44

52

Wu

HM

Huang

HY

Soong

YK

Leung

PCK

Wang

HS

Кисспептин регуляция подвижности децидуальных стромальных клеток человека посредством внутриклеточных тирозинкиназ FAK-Src

Hum Reprod

2019

34

1291

1301

млн. Лет

L

Li

G

Cao

G

Zhu

Y

Du

MR

Zhao

Y

Лю

Y

Ян

Y

Li

YX

Li

DJ

Ян

H

dNK способствуют взаимодействию между трофобластическими и эндотелиальными клетками через VEGF-C и HGF

Immunol Cell Biol

2017

95

695

704

Sayama

S

Nagamatsu

T

Schust

DJ

Itaoka

N

Ichikawa

M

Kozuma

S

Fujii

T

Децидуальные макрофаги человека подавляют продукцию IFN-гамма Т-клетками посредством костимулирующей передачи сигналов B7-h2: PD-1 на ранних сроках беременности

J Репрод Иммунол

2013

100

109

117

Hanna

J

Goldman-Wohl

D

Hamani

Y

Avraham

I

Greenfield

C

Natanson-Yar

D

Cohen-Daniel

L

Arnon

TI

Manaster

I

Gazit

R

Yutkin

V

Децидуальные NK-клетки регулируют ключевые процессы развития на стыке плода и матери человека

Nat Med

2006

12

1065

1074

Gomez

D

Shankman

LS

Nguyen

AT

Owens

GK

Обнаружение модификаций гистонов в определенных локусах генов в отдельных клетках в гистологических срезах

Nat Methods

2013

10

171

177

Biswas Shivhare

S

Bulmer

JN

Innes

BA

Hapangama

DK

Lash

GE

Измененная дифференцировка гладкомышечных клеток сосудов в сосудистой сети эндометрия при меноррагиях

Hum Reprod

2014

29

1884

1894

Ramathal

CY

Bagchi

IC

Taylor

RN

Bagchi

MK

Децидуализация эндометрия: мышей и мужчин

Semin Reprod Med

2010

28

17

26

Ashary

N

Tiwari

A

Modi

D

Имплантация эмбриона: война во времена любви

Эндокринология

2018

159

1188

1198

Наружный

V

Trundley

A

Gardner

L

Northfield

J

Chang

C

Apps

R

R

Естественные клетки-киллеры при беременности человека

Методы Мол Биол

2010

612

447

463

Моффет-Кинг

А

Естественные клетки-киллеры и беременность

Nat Rev Immunol

2002

2

656

663

Vacca

P

Mingari

MC

Moretta

L

Естественные клетки-киллеры при беременности человека

J Репрод Иммунол

2013

97

14

19

Liu

S

Diao

L

Huang

C

Li

Y

Zeng

Y

H

Роль децидуальных иммунных клеток в беременности человека

J Репрод Иммунол

2017

124

44

53

Сойка

ДК

Ян

L

Йокояма

WM

Естественные киллеры матки

Фронт Иммунол

2019

10

960

Манастер

I

Мандельбойм

O

Уникальные свойства человеческих NK-клеток слизистой оболочки матки

Плацента

2008

29

S60

S66

Red-Horse

K

Zhou

Y

Genbacev

O

Prakobphol

A

Foulk

R

McMaster

McMaster

Дифференциация трофобластов во время имплантации эмбриона и формирование границы раздела матери и плода

J Clin Invest

2004

114

744

754

Харрис

LK

Джонс

CJ

Аплин

JD

Молекулы адгезии в трофобласте человека — обзор. II. Трофобласт вневорсинчатый

Плацента

2009

30

299

304

McDonald

OG

Wamhoff

BR

Hoofnagle

MH

Owens

GK

Контроль связывания SRF с хроматином CArG-бокса регулирует экспрессию генов гладких мышц in vivo

J Clin Invest

2006

116

36

48

Брайтон

PJ

Маруяма

Y

Fishwick

K

Vrljicak

P

Tewary

S

0004 Fuji

Lucas

ES

Yamada

T

Woods

L

Lucciola

R

Hou Lee

Y

Удаление стареющих децидуальных клеток маточными естественными клетками-киллерами в циклическом эндометрии человека

Элиф

2017

6

Thiruchelvam

U

Dransfield

I

Saunders

PT

Critchley

HO

Важность макрофагов в эндометрии человека

J Leukoc Biol

2013

93

217

225

Edgell

TA

Rombauts

LJ

Salamonsen

LA

Оценка восприимчивости эндометрия: необходимость быстрого неинвазивного теста

Reprod Biomed Online

2013

27

486

496

Salamonsen

LA

Evans

J

Nguyen

HP

Edgell

TA

Микросреда имплантации человека: фактор репродуктивного успеха

Am J Reprod Immunol

2016

75

218

225

Brar

AK

Frank

GR

Kessler

CA

Cedars

MI

Handwerger

S

Прогестерон-зависимая децидуализация эндометрия человека опосредуется цАМФ

Эндокринная

1997

6

301

307

Weedon-Fekjaer

MS

Tasken

K

Обзор: пространственно-временная динамика передачи сигналов ХГЧ / цАМФ и регуляция функции плаценты

Плацента

2012

33

S87

S91

Crocker

IP

Wareing

M

Ferris

GR

Jones

CJ

Cartwright

JE

JE

Влияние сосудистого происхождения, кислорода и фактора некроза опухоли альфа на трофобластную инвазию материнских артерий in vitro

J Pathol

2005

206

476

485

Robson

A

Lash

GE

Innes

BA

Zhang

JY

Robson

SC

Дедифференцировка мышц спиральной артерии матки

Hum Reprod

2019

34

1428

1438

Hazan

AD

Smith

SD

Jones

RL

Whittle

W

Lye

SJ

Dunk CE

.

Сосудисто-лейкоцитарные взаимодействия: механизмы ремоделирования децидуальной спиральной артерии человека in vitro

Am J Pathol

2010

177

1017

1030

Vento-Tormo

R

Efremova

M

Botting

RA

Turco

MY

Vento-Tormo

M

KB Park

JE

Stephenson

E

Polanski

K

Goncalves

A

Gardner

L

Holmqvist

et al.

Одноклеточная реконструкция ранней границы раздела матери и плода у человека

Природа

2018

563

347

353

Dong

LH

Wen

JK

Miao

SB

Jia

Z

Hu

HJ

RR

, Sun

Хан

М

Байкалин ингибирует стимулированную PDGF-BB пролиферацию гладкомышечных клеток сосудов посредством подавления передачи сигналов PDGFRbeta-ERK и увеличения накопления p27 и предотвращает индуцированную повреждением гиперплазию неоинтимы

Cell Res

2010

20

1252

1262

Kingsley

K

Huff

JL

Rust

WL

Carroll

K

Martinez

AM

000 Plopper

ERK1 / 2 опосредует PDGF-BB стимулированную пролиферацию и миграцию клеток гладких мышц сосудов на ламинине-5

Biochem Biophys Res Commun

2002

293

1000

1006

юаней

X

Zhang

T

Yao

F

Liao

Y

Liu

F

Ren

Z

Diao

L

Li

Y

Zhou

B

He

F

Wang

L

THO комплекс-зависимый посттранскрипционный контроль вносит вклад в решение судьбы гладкомышечных клеток сосудов

Circ Res

2018

123

538

549

Saji

M

Taga

M

Matsui

H

Suyama

K

Kurogi

K

Minaguchi

Экспрессия генов и специфическое связывание тромбоцитарного фактора роста и его влияние на синтез ДНК в децидуальных клетках человека

Mol Cell Endocrinol

1997

132

73

80

Lockwood

CJ

Huang

SJ

Chen

CP

Huang

Y

Xu

J

Kayarz 9000

Kayisli

U

Koopman

L

Smedts

D

Buchwalder

LF

Schatz

F

Децидуальная клеточная регуляция естественных хемокинов, рекрутирующих клетки-киллеры: значение для патогенеза и прогнозирования преэклампсии

Am J Pathol

2013

183

841

856

Wallace

AE

Fraser

R

Cartwright

JE

Экстраворсинчатый трофобласт и децидуальные естественные клетки-киллеры: ремоделирующее партнерство

Hum Reprod Update

2012

18

458

471

Wu

X

Jin

LP

юаней

MM

Zhu

Y

Wang

MY

Li

DJ

DJ

Человеческие клетки трофобласта первого триместра привлекают CD56brightCD16- NK-клетки в децидуальную оболочку посредством экспрессии и секреции фактора 1 CXCL12 / стромальных клеток

J Immunol

2005

175

61

68

Wallace

AE

Cartwright

JE

Begum

R

Laing

K

Thilaganathan

B

Индуцированные трофобластом изменения в экспрессии хемокина 10 мотива C-x-C способствуют дедифференцировке гладкомышечных клеток сосудов во время ремоделирования спиральной артерии

Артериосклер Тромб Васк Биол

2013

33

e93

e101

Askie

LM

Duley

L

Henderson-Smart

DJ

Stewart

LA

Group PC

Антиагреганты для профилактики преэклампсии: метаанализ индивидуальных данных пациента

Ланцет

2007

369

1791

1798

Ляо

Y

Lonnerdal

B

miR-584 опосредует посттранскрипционную экспрессию рецептора лактоферрина в клетках Caco-2 и в тонком кишечнике мыши в перинатальный период

Int J Biochem Cell Biol

2010

42

1363

1369

Sun

Y

Xing

X

Liu

Q

Wang

Z

Xin

Y

Zhang

Лю

Y

Аутофагия, индуцированная гипоксией, снижает радиочувствительность пути HIF-1alpha / miR-210 / Bcl-2 в раковых клетках толстой кишки

Int J Oncol

2015

46

750

756

Bao

Q

Jia

H

Rong

A

Cao

Z

Zhang

Y

MiR-210 ингибирует индуцированный гипоксией апоптоз гладкомышечных клеток посредством нацеливания на MEF2C

Int J Clin Exp Pathol

2019

12

1846

1858

Кхонг

TY

Абдул Рахман

H

Экспрессия Bcl-2 задерживает послеродовую инволюцию вызванных беременностью сосудистых изменений в плацентарном ложе человека

Int J Gynecol Pathol

1997

16

138

142

Wang

H

Wang

L

Zhou

X

Luo

X

Liu

K

Jiang

Шао

Z

Шан

Z

Экзосомы OSCC регулируют miR-210-3p, направленную на EFNA3, чтобы способствовать ангиогенезу рака полости рта через путь PI3K / AKT

Biomed Res Int

2020

2020

Hannan

NJ

Jones

RL

Белый

CA

Salamonsen

LA

Хемокины, CX3CL1, CCL14 и CCL4, способствуют миграции трофобластов человека на границе раздела между плодом и матерью

Biol Reprod

2006

74

896

904

Jones

RL

Hannan

NJ

Kaitu’u

TJ

Zhang

J

Salamonsen

LA

Идентификация хемокинов, важных для рекрутирования лейкоцитов в эндометрий человека во время имплантации эмбриона и менструации

J Clin Endocrinol Metab

2004

89

6155

6167

Lu

H

Jin

LP

Huang

HL

Ha

SY

Yang

HL

Chang

DJ5

Li

MQ

CXCL12, происходящий из трофобластов, способствует обогащению CD56 (ярких) CD82 (-) CD29 (+) NK-клеток в децидуальной оболочке

Am J Reprod Immunol

2020

83

Smith

SDAJ

Harris

LK

Dunk

C

Jones

RL

Возможное участие хемокинов в рекрутировании клеток uNK и макрофагов для ремоделирования спиральных артерий

Reprod Sci

2009

16

110A

Tayade

C

Клык

Y

Черный

GP

VA

PJ

Erlebacher

A

Croy

BA

Дифференциальная транскрипция Eomes и T-bet во время созревания естественных клеток-киллеров матки мыши

J Leukoc Biol

2005

78

1347

1355

Рыжий

ML

Portilho

NA

Felker

AM

Mohammad

S

Mara

DL

Croy

Фактор транскрипции NFIL3 необходим для нормального плацентарного и эмбрионального развития, но не для дифференцировки клеток естественных киллеров матки (UNK) у мышей

Biol Reprod

2016

94

101

Sojka

DK

Plougastel-Douglas

B

Yang

L

Pak-Wittel

MA

Артемов

ova

C

Chase

JM

Rothman

PB

Yu

J

Riley

JK

Zhu

J

Резидентные в тканях естественные клетки-киллеры (NK) представляют собой линии клеток, отличные от NK-клеток тимуса и селезенки

Элиф

2014

3

e01659

длинный

JZ

Svensson

KJ

Tsai

L

Zeng

X

Roh

HC

Kong

X4

Lou

J

Lokurkar

I

Baur

W

Castellot

JJ

Rosen

ED

Гладкомышечное происхождение бежевых адипоцитов

Cell Metab

2014

19

810

820

Speer

MY

Yang

HY

Brabb

T

Leaf

E

Look

A

Lin

WL4

WL4 WL4

Дичек

D

Giachelli

CM

Гладкомышечные клетки дают начало остеохондрогенным предшественникам и хондроцитам в кальцифицирующих артериях

Circ Res

2009

104

733

741

Shankman

LS

Gomez

D

Cherepanova

OA

Salmon

M

Alencar

GF

Newman

AA

Greene

ES

Straub

AC

Isakson

B

Randolph

GJ

KLF4-зависимая фенотипическая модуляция гладкомышечных клеток играет ключевую роль в патогенезе атеросклеротических бляшек

Nat Med

2015

21

628

637

Bhurke

AS

Bagchi

IC

Bagchi

MK

Регулируемые прогестероном факторы эндометрия, контролирующие имплантацию

Am J Reprod Immunol

2016

75

237

245

Maliqueo

M

Echiburu

B

Crisosto

N

Половые стероиды модулируют маточно-плацентарную сосудистую систему: значение для акушерства и неонатальных исходов

Front Physiol

2016

7

152

Дики

RP

Hower

JF

Взаимосвязь уровней эстрадиола и прогестерона с кровотоком в матке на ранних сроках беременности

Ранняя беременность

1996

2

113

120

Альбрехт

ED

Bonagura

TW

Burleigh

DW

Эндерс

AC

Aberdeen

GW

Подавление эстрогеном инвазии вневорсинчатыми трофобластами спиральных артерий матки во время ранней беременности бабуина

Плацента

2006

27

483

490

Bonagura

TW

Babischkin

JS

Aberdeen

GW

Pepe

GJ

Albrecht

ED

Преждевременное повышение уровня эстрадиола на ранних сроках беременности павиана подавляет ремоделирование маточной артерии и экспрессию экстравирусного фактора роста эндотелия сосудов плаценты и интегринов альфа1бета1 и альфа5бета1

Эндокринология

2012

153

2897

2906

Aberdeen

GW

Bonagura

TW

Harman

CR

Pepe

GJ

Albrecht

ED

Подавление эстрогеном ремоделирования спиральной артерии матки трофобласта при беременности павианом: влияние на динамику кровотока матки и плода

Am J Physiol Heart Circ Physiol

2012

302

h2936

h2944

млн.

Сравнение электрофизиологических свойств гладкомышечных клеток сосудов в различных артериолах морских свинок

Шэн Ли Сюэ Бао

2010

62

421

426

Hill

MA

Meininger

GA

Клетки гладких мышц артериолярных сосудов: механотрансдукторы в сложной среде

Int J Biochem Cell Biol

2012

44

1505

1510

Заметки автора

© Автор (ы) 2020. Опубликовано Oxford University Press от имени Общества изучения репродукции.Все права защищены. Для получения разрешений обращайтесь по электронной почте: [email protected]

Анатомия, брюшная полость и таз, маточные артерии Статья

Введение

Маточные артерии — это главные кровеносные сосуды, снабжающие матку кровью. Они выделяют ветви, которые снабжают различные части матки и играют важную роль в поддержании кровоснабжения во время физиологических процессов, таких как изменение эндометрия во время менструального цикла и рост матки во время беременности.По ходу маточная артерия проходит кпереди от дистального отдела мочеточника; некоторые называют это «водой под мостом».

Устройство и функции

Есть две маточные артерии, по одной с каждой стороны (левая и правая). Маточная артерия — это ветвь внутренней подвздошной артерии, также называемой гипогастральной артерией. Правая маточная артерия — это ветвь правого переднего отдела внутренней подвздошной артерии. Маточная артерия проходит от латерального к медиальному направлению через нижнюю часть широкой связки, также называемой кардинальной связкой.На уровне перешейка матки маточная артерия делится на восходящую и нисходящую ветви. [1] [2] [3]

После бифуркации восходящая артерия поднимается вверх, рядом с маткой, и проходит извилистым путем с боковой стороной матки. Восходящая артерия у повторнородящих женщин становится более извилистой и извилистой по размеру и форме. Восходящая ветвь маточной артерии анастомозирует с яичниковой артерией. Яичниковая артерия — прямая ветвь брюшной аорты.Яичниковая артерия поставляет насыщенную кислородом кровь в яичник, маточную трубу и матку. В миометрии маточная артерия разветвляется на дугообразную артерию, лучевую артерию, спиральную артерию и базальную артерию.

Нисходящая ветвь снабжает кровью шейку матки и влагалище. Дугообразная артерия вокруг шейки матки также называется круговой артерией шейки матки. Маточная артерия также ведет через нее ветви к маточной трубе и мочеточнику. Цервиковагинальные ветви анастомозируют с вагинальными артериями, образуя непроходимые артерии влагалища.

Дугообразные артерии матки снабжают кровью гладкую мускулатуру матки, называемую миометрием. Дугообразные артерии проникают по окружности миометрия и снабжают кровью переднюю и заднюю стенки матки. Дугообразная артерия заканчивается спиральной артерией, которая снабжает эндометрий, децидуальную оболочку и плаценту во время беременности. Ритмичное сокращение и расслабление этих сосудов помогает поддерживать стабильность эндометрия и необходимый контроль кровоснабжения.Эти сосуды обычно проявляются в поздней лютеиновой фазе. Перед началом менструации и во время менструации эти сосуды менее заметны. Эстроген вызывает увеличение размера и количества этих сосудов и увеличивает кровоток. Эстроген отвечает за разрастание эндометрия матки во время пролиферативной фазы менструального цикла.

Спиральные артерии снабжают кровью эндометрий матки, а точнее функциональную зону, которая отходит во время менструации.В гистологии выявление спиральных артерий помогает поставить диагноз лютеиновой фазы менструального цикла.

Базальные артерии снабжают кровью эндометрий, а точнее базальную зону. В базальной зоне начинается регенерация обнаженного эндометрия после менструации. Эта регенерация происходит под действием эстрогена во время пролиферативной фазы менструального цикла. Поддержание стромы происходит с помощью прогестерона. [4]

Хирургические рекомендации

При патологических состояниях, таких как миома матки, ход маточной артерии и ее ветвей значительно искажается.Миома матки — самая распространенная опухоль матки у женщин репродуктивного возраста. Маточная артерия снабжает кровью растущие миомы, и это кровоснабжение способствует их росту. Большинство миомы доброкачественные и бессимптомные. Симптоматические миомы могут вызывать сильную тазовую боль, дисменорею, меноррагию и железодефицитную анемию. Симптоматические миомы являются наиболее частым показанием к гистерэктомии в США. Симптоматические миомы обычно лечат хирургическим путем. После репродуктивного возраста миому матки можно лечить гонадотропин-рилизинг-гормоном (ГнРГ) для уменьшения размеров миомы.Эмболизация маточной артерии блокирует приток крови к миомам, уменьшая их в размерах; эта радиологическая процедура может улучшить симптомы у многих пациентов. Не рекомендуется в репродуктивном периоде, так как может вызвать атрофию яичников, что приведет к симптомам менопаузы. [5]

Во время гистерэктомии важно изолировать нисходящий мочеточник от маточной артерии, чтобы избежать повреждения мочеточника. Хирургическое повреждение нижней части мочеточника происходит во время сложной операции, например, при тубо-яичниковом абсцессе, образовании таза или различных злокачественных заболеваниях органов малого таза.Часто во время операции упускаются травмы мочеточника. Послеоперационная цистоскопия и визуализация свободного истечения красителя из обоих мочеточников могут гарантировать сохранность мочеточников [6].

Во время кесарева сечения может быть обильное кровотечение во время операции. Наложение швов или сдавливание матки или медицинское вмешательство могут оказаться безуспешными. В этой ситуации двусторонняя перевязка маточной артерии может остановить кровотечение. После выздоровления автоматически происходит реканализация маточных сосудов.

Клиническая значимость

Беременность — это физиологическое состояние, при котором гладкие мышцы матки и кровеносные сосуды непрерывно разрастаются.Во время беременности наблюдается значительное снижение сосудистого и мышечного тонуса матки и усиление маточного кровотока. Повышенное количество стероидных гормонов во время беременности, таких как эстроген, прогестерон и кортизол, влияет на сосудистую сеть и мускулатуру матки. Эстроген является основным фактором увеличения размера матки и утолщения стенки матки. [4]

Миометрий, средний слой стенки матки, в основном состоит из гладкомышечных клеток. Миометрий при беременности сильно увеличивается.Во время нормального гестационного периода сокращений матки не наблюдается. Предотвращение сокращения достигается за счет подавления прогестерона миоцитов. Во время беременности миоциты подвергаются постоянному растяжению, гипертрофии и ремоделированию. Эти физиологические изменения необходимы для успешной беременности. На ранних сроках беременности вневорсинчатые цитотрофобласты проникают в децидуализированный эндометрий и миометрий. Спиральные артерии трансформируются в крупные сосуды с низким сопротивлением, что происходит с постепенной потерей нормальной мышечно-эластической структуры артериальной стенки.При преэклампсии или задержке роста плода трофобластическая инвазия и дисфункция спиральной артерии сдерживают нормальные физиологические изменения.

Во время беременности допплеровское исследование маточной артерии может использоваться для сканирования кровотока в маточной артерии. Это исследование показывает степень обструкции маточной артерии. При задержке роста плода, сахарном диабете, гипертонических расстройствах и преэклампсии наблюдается нарушение кровоснабжения плаценты и плода. Цветная визуализация маточной артерии и ультразвуковое допплеровское исследование с использованием импульсной волны могут быть полезны для оценки кровотока в маточной артерии, среднего артериального давления и индекса сопротивления маточной артерии.Беременные пациентки с повышенным средним артериальным давлением, но с нормальным индексом сопротивления маточной артерии, могут рассчитывать на благоприятный исход беременности. Пациенты с повышенным средним артериальным давлением и аномальным индексом сопротивления маточной артерии могут иметь неблагоприятный исход.

Увеличение маточно-плацентарного кровотока необходимо для нормального исхода беременности. Это достигается за счет систематического роста и ремоделирования маточного кровообращения и образования плаценты. Во время беременности диаметр основной маточной артерии увеличивается примерно вдвое.Утолщение артериальной стенки при увеличении диаметра артерии отсутствует.

У женщин в постменопаузе кальцификаты могут обнаруживаться в стенках дугообразных артерий. Эти кальцинированные пятна являются эхогенными и выглядят как линейные эхо с затемнением. Это нормальный процесс старения, который может усиливаться у пациентов с диабетом. Эти кальцифицированные поражения отличаются от кальцинированных миомы.

Регулирование ремоделирования спиральной артерии матки: обзор

Роль корина в инвазии трофобластов и ремоделировании спиральной артерии матки при беременности

Крюппель-подобный фактор 17 стимулирует экспрессию корки матки и способствует ремоделированию спиральной артерии во время беременности

Значение

Во время беременности кровеносные сосуды в матке увеличиваются в размере, обеспечивая больший приток крови и питательных веществ для растущего плода.Корин — это фермент, который ускоряет этот процесс. В этом исследовании мы стремились понять, как контролируется выработка корина матки. В экспериментах с человеческими маточными клетками и беременными мышами мы идентифицировали белок, названный Krüppel-подобным фактором 17 (KLF17), который включает ген корина в беременной матке. У генетически модифицированных мышей дефицит Klf17 предотвращает выработку корина матки, уменьшает размер маточных сосудов и вызывает высокое кровяное давление во время беременности. Эти результаты показывают, что KLF17 является ген-контролирующим белком, важным для функции матки во время беременности.

Abstract

Ремоделирование спиральной артерии — важный физиологический процесс беременной матки, который увеличивает приток крови к плоду. Нарушение ремоделирования спиральной артерии способствует преэклампсии, серьезному заболеванию беременных. Корин, трансмембранная сериновая протеаза, активируется в беременной матке, что способствует ремоделированию спиральной артерии. На сегодняшний день механизм, лежащий в основе активации корки матки, остается неизвестным. Здесь мы показываем, что Krüppel-подобный фактор (KLF) 17 является ключевым фактором транскрипции для экспрессии корина матки во время беременности.В культивируемых клетках эндометрия матки человека KLF17 связывается с промотором CORIN и усиливает активность промотора. Нарушение гена KLF17 в клетках эндометрия отменяет экспрессию CORIN . У мышей Klf17 активируется в беременной матке. Дефицит Klf17 предотвращает экспрессию в матке Corin во время беременности. Более того, мыши с дефицитом Klf17 и имеют плохо реконструированные спиральные артерии матки и развивают гестационную гипертензию и протеинурию.Вместе наши результаты показывают важную функцию KLF17 в регулировании экспрессии Corin и физиологии матки во время беременности.

Во время беременности спиральные артерии матки подвергаются процессу ремоделирования, в ходе которого гладкомышечные клетки в стенке сосуда и эндотелиальные клетки, выстилающие просвет, заменяются трофобластами, полученными из плаценты (1). Ремоделированные спиральные артерии сильно расширены, что снижает сопротивление сосудов матери и увеличивает кровоснабжение плода.Преэклампсия — это заболевание, которым страдают от 5 до 8% беременных женщин и вызывают смерть матери и плода (2). Нарушение ремоделирования спиральной артерии является основным фактором патогенеза преэклампсии (2-4). На сегодняшний день молекулярные механизмы, лежащие в основе ремоделирования спиральной артерии, полностью не изучены.

Предсердный натрийуретический пептид (ПНП) ​​- это сердечный гормон, регулирующий водно-солевой баланс и артериальное давление (5). Он синтезируется в виде предшественника, то есть про-ANP, который превращается в зрелый ANP с помощью корина, трансмембранной сериновой протеазы, высоко экспрессируемой в сердце (6, 7).Помимо сердца, корин и ПНП экспрессируются в тканях вне сердца, таких как почки (8⇓ – 10), волосяные фолликулы (11, 12) и развивающиеся кости (13, 14). Недавно мы и другие показали, что корин активируется в беременной матке, где корин и ANP способствуют инвазии трофобластов и ремоделированию спиральной артерии (15, 16). У беременных мышей дефицит корина и ANP нарушает ремоделирование спиральной артерии, вызывая гестационную гипертензию и протеинурию, фенотип, подобный преэклампсии (15, 17, 18).У людей, у женщин с преэклампсией сообщалось о снижении уровней информационной РНК (мРНК) и белка корина, а также о вредоносных вариантах CORIN (15, 19, 20). Эти данные показывают, что повышение регуляции корина матки является частью физиологической реакции при нормальной беременности. Однако остается неизвестным, как регулируется экспрессия корина в беременной матке.

В сердце экспрессия натрийуретического пептида контролируется GATA-4, фактором транскрипции цинкового пальца (21, 22). Сходный GATA-4-зависимый механизм является критическим для экспрессии сердечного корина.Мы показали, что промоторы генов корина человека и мыши содержат консервативную последовательность, которая необходима для связывания GATA-4 и экспрессии корина в кардиомиоцитах (23). GATA-4 в первую очередь является фактором транскрипции сердца, но не экспрессируется в матке (24). Вероятно, что транскрипционный механизм, контролирующий экспрессию корина в матке, отличается от такового в сердце.

Чтобы проверить эту гипотезу, мы проанализировали активность промотора CORIN в клетках эндометрия и сердца.Мы также исследовали экспрессию корина и фактора транскрипции в децидуализированных клетках эндометрия человека и беременных матках мышей. Мы определили Krüppel-подобный фактор 17 (KLF17) как ключевой фактор транскрипции для экспрессии корина матки. У мышей дефицит Klf17 предотвращал экспрессию Corin в беременной матке. У Klf17 -дефицитных мышей развилась индуцированная беременностью гипертензия и протеинурия. Эти находки указывают на важную роль KLF17 в экспрессии Corin и физиологии матки во время беременности.

Результаты

Человек

Ранее мы идентифицировали консервативную GATA-связывающую последовательность в промоторе CORIN человека, необходимую для экспрессии корина в кардиомиоцитах (23). В этом исследовании мы проанализировали фрагмент промотора CORIN длиной 405 п.н., содержащий GATA-связывающую последовательность (рис. 1 A ). В анализе люциферазы промоторная активность была обнаружена в клетках AN3-CA эндометрия матки человека и кардиомиоцитах HL-1 мыши, в которых сообщалось об экспрессии эндогенного корина (25, 26) (рис.1 B и C ). Внутри этого промоторного фрагмента сайт связывания E-box и два сайта связывания KLF располагались выше сайта связывания GATA (рис. 1 A и SI, приложение , рис. S1). Делеция сайта связывания E-box оказывала незначительное влияние на промоторную активность CORIN в клетках AN3-CA и HL-1 (рис. 1 A — C ). Дальнейшая делеция двух сайтов связывания KLF устраняет активность промотора в клетках AN3-CA, но не в HL-1 (рис.1 A — C ), предполагая возможную роль сайтов связывания KLF в экспрессии корина в клетках эндометрия матки.

Активность промотора CORIN в клетках эндометрия и кардиомиоцитах матки. ( A ) Иллюстрация конструкции люциферазы с фрагментом промотора CORIN длиной 405 п.н. с сайтом связывания E-box, двумя сайтами связывания KLF и сайтом связывания GATA (P405) и двумя конструкциями с 236- и 161 п.н., соответственно, усеченные фрагменты промотора CORIN (P236 и P161).( B и C ) Люциферазная активность в клетках эндометрия AN3-CA ( B ) и HL-1 ( C ), трансфицированных конструкциями промотора CORIN . Конструкцию pGL3 использовали в качестве фонового контроля. ( D ) Иллюстрация промоторных конструкций CORIN с мутациями (жирным курсивом) в одном (KM1 и KM2) или обоих (KM3) сайтах связывания KLF. ( E и F ) Люциферазная активность в клетках AN3-CA ( E ) и HL-1 ( F ), трансфицированных конструкциями промотора CORIN .( G ) Иллюстрация конструкции промотора CORIN с мутациями (жирные курсивные буквы) в сайте связывания GATA (GM). ( H и I ) Люциферазная активность в клетках AN3-CA ( H ) и HL-1 ( I ), трансфицированных конструкциями промотора CORIN . n = от 3 до 6 на группу. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего; Значения P анализировали с помощью двустороннего критерия Стьюдента t . нс, не имеет значения.

Чтобы проверить наши результаты, мы мутировали сайты связывания KLF, по отдельности или вместе (рис. 1 D ). В анализе люциферазы промоторный фрагмент с мутациями в отдельных сайтах связывания KLF имел пониженную активность в клетках AN3-CA (фиг. 1 E ). Когда оба сайта связывания KLF были мутированы, активность промотора отменялась в клетках AN3-CA, но не в HL-1 (фиг. 1 E и F ). Напротив, мутации в сайте связывания GATA отменяли промоторную активность в клетках HL-1, но не в клетках AN3-CA (рис.1 G — I ). Эти результаты показывают, что экспрессия корина в клетках эндометрия матки контролируется транскрипционным механизмом с участием фактора (ов) транскрипции KLF, но не GATA.

Экспрессия корина матки и KLF у мышей, получавших прогестерон, и беременных мышей.

Семья KLF состоит из 17 членов (27). Чтобы идентифицировать члена (ов) KLF, ответственного за экспрессию корина в беременной матке, мы обработали овариэктомированных мышей C57BL / 6 эстрогеном или прогестероном ( SI Приложение , рис.S2 A ). С помощью qRT-PCR мы обнаружили повышенные уровни мРНК Corin в матке у мышей, получавших прогестерон, но не получавших эстроген, по сравнению с таковыми у мышей, получавших носитель (фиг. 2 A ). Затем мы проанализировали экспрессию в матке всех 17 генов Klf с помощью qRT-PCR у овариэктомированных мышей, получавших прогестерон. Мы обнаружили повышенные уровни мРНК в матке Corin , Klf2 , Klf9 , Klf15 и Klf17 , но не остальных генов Klf (рис.2 B и SI Приложение , рис. S2 B ). Мы подтвердили эти результаты с помощью анализа qRT-PCR тканей матки беременных мышей C57BL / 6 на разных (G) днях гестации (рис. 2 C ). Эти результаты показывают, что Klf2, Klf9, Klf15 и Klf17 являются возможными кандидатами, ответственными за активацию корина в беременной матке.

Corin и Klf в матках мышей. ( A ) Уровни мРНК Corin в матке от овариэктомированных мышей, получавших носитель, эстроген или прогестерон.( B ) Уровни мРНК Corin , Klf2 , Klf9 , Klf15 и Klf17 в матках от овариэктомированных мышей, получавших носитель или прогестерон. ( C ) Уровни мРНК Corin , Klf2 , Klf9 , Klf15 и Klf17 в матках небеременных (NP) и беременных мышей C57BL / 6 на 4,5, 7,5 и 12,5 гестационных днях. n = от 4 до 5 на группу в A ; n = 10 на группу в B ; n = от 9 до 10 на группу в C .Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего; Значения P анализировали с помощью ANOVA ( A, и C ) или двустороннего теста Стьюдента t ( B ). нс, не имеет значения.

Влияние экспрессии KLF на активность промотора

Для изучения функции кандидатов в KLF мы котрансфицировали клетки AN3-CA с промоторными конструкциями CORIN и плазмидами, экспрессирующими человеческие белки KLF2, KLF9, KLF15 и KLF17.Повышенная промоторная активность была обнаружена, когда плазмиды, экспрессирующие KLF2 и KLF17, но не KLF9 и KLF15, котрансфицировали промоторной конструкцией с сайтами связывания KLF (фиг. 3 A и B ). Путем вестерн-блоттинга мы подтвердили экспрессию рекомбинантного KLF в трансфицированных клетках (фиг. 3 C ). В этих экспериментах промоторная активность не увеличивалась, если котрансфекция проводилась с использованием промоторных конструкций CORIN с удаленными сайтами связывания KLF (рис.3 D ) или мутировавший (рис. 3 E ). В отличие от клеток AN3-CA, экспрессия рекомбинантных KLF2 и KLF17 в кардиомиоцитах HL-1 не увеличивала активность промотора при использовании конструкций CORIN с сайтами связывания KLF или без них ( SI Приложение , рис. S3 A — D ). Эти результаты показывают, что KLF2 и / или KLF17, вероятно, ответственны за активацию корина в беременной матке.

Влияние экспрессии рекомбинантного белка KLF на активность промотора CORIN в клетках AN3-CA эндометрия матки.( A ) Иллюстрация использованных промоторных конструкций CORIN . ( B ) Люциферазная активность в клетках AN3-CA, котрансфицированных конструкцией промотора P236 CORIN и контрольным вектором (Vec) или плазмидами, экспрессирующими человеческий KLF2 (K2), KLF9 (K9), KLF15 (K15) или KLF17 ( К17). n = 8 на группу. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего; P Значения анализировали с помощью ANOVA. нс, не имеет значения. ( C ) Вестерн-блоттинг рекомбинантных белков KLF в трансфицированных клетках с использованием антитела против FLAG.( D и E ) Люциферазная активность в клетках AN3-CA, трансфицированных конструкцией промотора P405 CORIN (положительный контроль) или котрансфицированных промотором P161 ( D ) или KM3 ( E ) промотор CORIN конструкция и контрольный вектор (Vec) или плазмиды, экспрессирующие человеческий KLF2 (K2), KLF9 (K9), KLF15 (K15) или KLF17 (K17). n = 3 на группу. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего; P Значения (по сравнению с P405) и нс (несущественно) (vs.группа, котрансфицированная вектором) были проанализированы с помощью ANOVA.

Повышенная экспрессия корина и KLF17 в децидуализированных стромальных клетках эндометрия человека.

Стромальные клетки эндометрия человека (HESC) обычно используются для индукции децидуализации в культуре, чтобы имитировать клетки эндометрия в беременной матке (28). Мы культивировали HESC в среде для децидуализации и обнаружили повышенные уровни мРНК PRL (кодирующий пролактин, маркер децидуализации) и CORIN с помощью qRT-PCR (рис.4 A ), что соответствует повышенной регуляции корина в матке беременной (15). Посредством вестерн-блоттинга были обнаружены повышенные уровни KLF17 в децидуализированных HESC (фиг. 4 B ). Напротив, уровни KLF2 не изменились в обработанных аналогичным образом HESC (фиг. 4 C ). Мы подтвердили эти результаты с помощью иммуногистохимии (фиг. 4 D ) и коиммунофлуоресцентного окрашивания (фиг. 4 E ), которые показали повышенное окрашивание цитоплазмы и мембран корина и ядерное окрашивание KLF17 в децидуализированных, но не контрольных, HESC.В соответствии с результатами вестерн-блоттинга иммуногистохимия показала сходные уровни ядерного окрашивания KLF2 в HESC до и после децидуализации ( SI, приложение , рис. S4).

KLF17 и KLF2 в децидуализированных HESC. ( A ) Культивированные HESC индуцировали децидуализацию. Уровни мРНК PRL ( верхний, ) и CORIN ( нижний ) в указанные моменты времени анализировали с помощью qRT-PCR. ( B и C ) Вестерн-блоттинг эндогенных белков KLF17 ( B ) и KLF2 ( C ) в HESC, культивируемых в децидуализационной среде, с течением времени.GAPDH использовали в вестерн-блоттинге ( верх, ) для расчета относительных уровней экспрессии белка ( низ ). n = 5 на группу в A ; n = 3 на группу в B и C . На гистограммах данные представлены как среднее ± SEM; нс, не имеет значения; ** P <0,01 по сравнению с контролем в момент времени 0 в том же эксперименте, согласно анализу ANOVA. ( D и E ) Иммуногистохимия ( D ) и коиммунофлуоресцентное окрашивание ( E ) эндогенных белков корина и KLF17 в контрольных (неиндуцированных) и децидуализированных (индуцированных) HESC.В D нормальный IgG использовали в качестве отрицательного контроля. Данные представляют из трех независимых экспериментов. (Шкала 20 мкм.)

Иммунопреципитационный анализ хроматина.

Чтобы проверить, связывается ли KLF17 непосредственно с промотором CORIN , мы выполнили анализ иммунопреципитации хроматина (ChIP) в HESC до и после децидуализации. Положительные фрагменты ПЦР были обнаружены, когда ChIP проводился с антителом против KLF17 в децидуализированных, но не контрольных HESC (рис.5 A и B ). Напротив, при использовании контрольного IgG или антитела против KLF2 или против KLF9 не было обнаружено никаких ПЦР-фрагментов (фиг. 5 B ). В положительном контроле фрагменты ПЦР были обнаружены, когда ChIP проводился с антителом против гистона 3 в HESC до и после децидуализации (фиг. 5 B ). Результаты были подтверждены дополнительным анализом qPCR ( SI, приложение , рис. S5, A ), показывающим, что KLF17, но не KLF2, связывается непосредственно с промотором CORIN в децидуализированных HESC.

ChIP в HESC и экспрессия CORIN в HESC KLF17 -KO. ( A ) Иллюстрация анализа ChIP, в котором фрагменты хроматина из неиндуцированных и индуцированных HESC осаждали антителами против гистона 3 (h4) (положительный контроль) или белков KLF и использовали для ПЦР с праймерами для сайтов, отличных от KLF и KLF. ( B ) Продукты ПЦР представлены в агарозных гелях. ( C ) Ген KLF17 был разрушен в HESC с использованием CRISPR / Cas9.Показаны данные частичного секвенирования HESC WT и KLF17 -KO. Красный прямоугольник указывает на удаленную последовательность. ( D ) Вестерн-блоттинг эндогенного белка KLF17 в HESC WT и KLF17 -KO без (-) или с (+) децидуализацией (индукцией). GAPDH был контролем. Представлены несмежные дорожки из того же вестерн-блоттинга. Данные представляют из трех независимых экспериментов. ( E ) Относительные уровни мРНК CORIN в HESC WT и KLF17 -KO без (неиндуцированной) или с (индуцированной) децидуализацией. n = 5 на группу. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего; Значения P анализировали с помощью двустороннего критерия Стьюдента t . нс, не имеет значения.

Corin Expression in

Чтобы определить функцию KLF17 в повышающей регуляции экспрессии корина в клетках эндометрия матки, мы разрушили ген KLF17 в HESC с помощью CRISPR / Cas9 (рис. 5 C ). При вестерн-блоттинге белок KLF17 не был обнаружен в HESC KLF17 -KO до или после децидуализации (рис.5 D ). В qRT-PCR в децидуализированных HESC были обнаружены сильно повышенные уровни мРНК CORIN по сравнению с таковыми в контрольных клетках (фиг. 5 E ). Такая повышающая регуляция, однако, не была обнаружена в HESC KLF17 -knockout (KO) (рис. 5 E ). Мы подтвердили эти результаты в отдельной линии HESC KLF17 -KO, в которой ген KLF17 был разрушен в другом сайте экзона 1 ( SI Приложение , рис. S5 B — D ).Эти данные указывают на критическую роль KLF17 в активации CORIN в децидуализированных клетках эндометрия матки человека.

Поколение

Чтобы понять функциональную важность Klf17 in vivo, мы использовали эмбриональные стволовые клетки мыши с нарушенным аллелем Klf17 для получения мышей Klf17 ^{— / —} ( SI Приложение , рис. S6 A ). и B ). Klf17 ^{— / —} мыши были жизнеспособны без заметных физических отклонений.При вскрытии трупов и гистологических исследованиях не было обнаружено явных дефектов в основных органах, включая семенник, в котором обнаружена экспрессия Klf17 (29). При ОТ-ПЦР повышающая регуляция Klf17 и Corin в матке была обнаружена у беременных мышей дикого типа (WT), но не Klf17 ^{— / —} , мышей (фиг. 6, A ). Соответственно, qRT-PCR показала заметное снижение уровней мРНК Corin в матке у беременных мышей Klf17 ^{— / —} по сравнению с таковыми у беременных мышей WT (рис.6 В ). Результаты были подтверждены вестерн-блоттингом белков Klf17 и Corin в образцах матки мышей WT и Klf17 ^{— / —} ( SI Приложение , рис. S7, A, и B ). Напротив, сердечные уровни мРНК Corin были сходными у небеременных и беременных мышей WT и Klf17 ^{— / —} в анализах ОТ-ПЦР и qRT-PCR ( SI Приложение , Рис. S7, C и D ).

и фертильность у мышей Klf17 ^{— / —} . ( A ) Уровни мРНК Klf17 и Corin в матках небеременных (NP) и беременных (G12.5 и G18.5) мышей WT и Klf17 ^{— / —} (KO) мышей, как анализировали с помощью ОТ-ПЦР. Образцы, в которых не использовались матрицы кДНК, были отрицательными контролями (Ctr). ( B ) Относительные уровни мРНК Corin у беременных (G12.5 и G18.5) Мыши WT и KO по результатам анализа с помощью qRT-PCR. n = от 8 до 14 на группу. ( C ) Количество и процентное соотношение Klf17 ^{+ / +} , Klf17 ^+/− и Klf17 ^{— / —} щенков в 28 помётах из 18 Klf17 ^+/− мышей. ( D ) Количество детенышей в помете от вязок WT × WT ( n = 22) и KO × KO ( n = 52). ( E ) Репрезентативные изображения эмбрионов G12.5 самок WT и KO спаривались с самцами того же генотипа. Стрелки указывают на аномальные эмбрионы. ( F ) Репрезентативные изображения с большим увеличением (× 16), показывающие нормальный эмбрион от мыши WT и два эмбриона (один нормальный и один ненормальный) от мыши KO. Гистограмма показывает процент нормальных и аномальных эмбрионов в 90 эмбрионах от мышей KO. ( G ) Количество детенышей в помете от самок WT и KO, повязанных с самцами WT или KO. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего; Значения P анализировали с помощью двустороннего теста Стьюдента t ( B и D ) или ANOVA ( G ).нс, не имеет значения.

Фертильность

Мы скрестили Klf17 ^+/- мышей и нашли ожидаемое менделевское соотношение Klf17 ^{+ / +} , Klf17 ^+/- и Klf17 ^{— / —} потомков (рис. 6 C ), что указывает на отсутствие явной эмбриональной потери у беременных мышей Klf17 ^+/- .Спаривание Klf17 ^{— / —} самцов и самок мышей давали меньше детенышей на помет по сравнению с Klf17 ^{+ / +} самцов и самок (4,1 ± 0,3 [ n = 52] по сравнению с 7,1 ± 0,4 [ n = 22]; P <0,01) (рис. 6 D ), что указывает на гибель плода у беременных мышей Klf17 ^{— / —} . Затем мы исследовали эмбрионы беременных мышей Klf17 ^{+ / +} и Klf17 ^{— / —} , спарившихся с самцами того же генотипа.На G12,5 d общее количество эмбрионов на мышь у мышей Klf17 ^{+ / +} и Klf17 ^{— / —} было одинаковым (7,2 ± 0,5 [ n = 11] против 7,6 ± 0,7 [ n = 17]; P = 0,64) (Рис. 6 E ), что предполагает аналогичное оплодотворение и имплантацию эмбриона между Klf17 ^{+ / +} и Klf17 ^{— / —} мышей. Однако у мышей Klf17 ^{— / —} часть эмбрионов (29/90, 32.2%) были маленькими и аномальными, тогда как другие эмбрионы (61/90, 67,7%) были неотличимы по размеру и морфологии от таковых у мышей Klf17 ^{+ / +} (Рис.6 E и F ). Гистологический анализ показал некроз тканей аномальных эмбрионов мышей Klf17 ^{— / —} ( SI Приложение , рис. S8). Из 128 обследованных эмбрионов Klf17 ^{+ / +} мышей только 3 (3/128, 2.3%) оказались ненормальными.

Чтобы определить, была ли гибель плода вызвана дефицитом Klf17 у самцов или самок мышей, мы скрестили Klf17 ^{+ / +} и Klf17 ^{— / —} мышей с мышами того же типа. или другой генотип. Щенков в помете от Klf17 ^{— / —} самок, вне зависимости от вязки с Klf17 ^{+ / +} или Klf17 ^{— / —} самцов, было намного меньше, чем от Klf17 ^{+ / +} самок, при вязке с Klf17 ^{+ / +} или Klf17 ^{— / —} самцов (рис.6 G ). Эти результаты показывают, что гибель плода была вызвана дефицитом Klf17 у самок мышей, независимо от генотипа у спаривающихся самцов или полученных плодов, что указывает на важность Klf17 в матке беременной, но не в плаценте или других тканях плода.

Инвазия трофобластов и маточные спиральные артерии у мышей

Корин способствует инвазии трофобластов и ремоделированию спиральной артерии в матке беременной (15). Мы провели гистологический и иммуногистохимический анализ у беременных мышей Klf17 ^{+ / +} и Klf17 ^{— / —} .На G12,5 d мы обнаружили инвазию трофобластов, на что указывало окрашивание цитокератина, в децидуальной оболочке мышей Klf17 ^{+ / +} (фиг. 7, A и B ). Для сравнения, инвазия трофобластов была заметно снижена в децидуальной оболочке мышей Klf17 ^{— / —} (фиг. 7, A, и B, ). На G18.5 d децидуальные артерии у мышей Klf17 ^{+ / +} были больше в диаметре по сравнению с таковыми у мышей Klf17 ^{— / —} (рис.7 C и D ). В отличие от мышей Klf17 ^{+ / +} , децидуальные артерии у мышей Klf17 ^{— / —} имели больше гладкомышечных клеток, на что указывало окрашивание α-гладкомышечного актина (SMA) (рис. 7 D ). Эти результаты показывают, что инвазия трофобластов и ремоделирование спиральной артерии матки нарушены у беременных мышей Klf17 ^{— / —} .

Инвазия трофобластов и ремоделирование спиральной артерии у мышей Klf17 ^{— / —} .( A и B ) Плацентарные (P) и маточные (U) срезы мышей WT и Klf17 ^{— / —} (KO) на G12.5 окрашивали H&E ( A ) или иммунное окрашивание антителом против цитокератина 18 (Cytok) ( B ). Области в рамке на изображениях с малым увеличением (× 25) ( верхний ряд, ) показаны при большем увеличении (× 100) ( нижний ряд ). Эндоваскулярная инвазия трофобластов в децидуальных отделах указана стрелками.( C и D ) Срезы плаценты (P) и матки (U) мышей WT и KO на G18.5 были окрашены H&E ( C ) или иммуноокрашены антителами против SMA ( D ). Области в рамке изображений с низким увеличением (× 25) ( верхний ряд, ) показаны с большим увеличением (× 100) ( нижний ряд ). Положительное окрашивание SMA в децидуальных артериях у мышей KO указано стрелками. Данные являются репрезентативными для исследований, по крайней мере, на пяти мышах в каждой группе.

Гипертония и протеинурия, вызванные беременностью, у мышей

Нарушение инвазии трофобластов и ремоделирование спиральной артерии способствуют преэклампсии, заболеванию, характеризующемуся гестационной гипертензией и протеинурией. Мы измерили артериальное давление у небеременных и беременных мышей Klf17 ^{+ / +} и Klf17 ^{— / —} . До беременности или при G12,5 дн у мышей Klf17 ^{+ / +} и Klf17 ^{— / —} артериальное давление было примерно одинаковым (рис.8 А ). На G18,5 дн артериальное давление у мышей Klf17 ^{— / —} увеличилось по сравнению с таковыми в небеременности или на G12,5 дн (121,2 ± 1,3 [ n = 12] по сравнению с 104,6 ± 1,5 [ n = 14] или 106,1 ± 2,3 [ n = 14] мм рт. 1,3 [ n = 12] по сравнению с 103,6 ± 2,8 [ n = 8] мм рт. Ст .; P <0.001) (рис.8 A ). Эти результаты показывают, что у мышей Klf17 ^{— / —} развивается гипертензия, вызванная беременностью.

Гипертония, протеинурия и ишемические клубочки у мышей Klf17 ^{— / —} . ( A ) Систолическое артериальное давление (АД) у небеременных (NP) и беременных (G12.5 и G18.5) мышей WT и Klf17 ^{— / —} (KO). n = от 8 до 14 на группу. ( B ) Уровни белка в моче у NP и беременных (G12.5 и G18.5) мышей WT и KO. n = от 7 до 16 на группу. ( C ) Гистология клубочков на срезах почек, окрашенных PAS и трихромом по Массону, от мышей NP и беременных (G12.5 и G18.5) мышей WT и KO. (Шкала 20 мкм). ( D ) Гломерулярные эритроциты (RBC) подсчитывали в почечных срезах мышей NP и беременных (G12.5 и G18.5) мышей WT и KO. Для A , B и D данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего; P Значения анализировали с помощью ANOVA; нс, не имеет значения.

Затем мы измерили уровни белка в моче у мышей Klf17 ^{+ / +} и Klf17 ^{— / —} . Сходные уровни белка в моче были обнаружены у мышей Klf17 ^{+ / +} и Klf17 ^{— / —} до беременности или на G12,5 d (рис. 8 B ). На G18,5 d уровень белка в моче увеличился у мышей Klf17 ^{— / —} , но не у Klf17 ^{+ / +} , мышей (237.2 ± 12,9 [ n = 12] против 103,4 ± 21,2 [ n = 7] мг / дл; P <0,001) (Рис.8 B ). На 7 день послеродового периода уровень артериального давления и белка в моче у мышей Klf17 ^{— / —} снизился до аналогичных уровней у контрольных мышей Klf17 ^{+ / +} ( SI Приложение , рис. S9) .

При гистологическом анализе морфология клубочков у небеременных и беременных Klf17 ^{+ / +} мышей и небеременных Klf17 ^{— / —} мышей оказались нормальными при окрашивании периодической кислотой по Шиффу (PAS) и по Массону. Срезы почек, окрашенные трихромом (рис.8 С ). У беременных мышей Klf17 ^{— / —} , особенно на поздней стадии гестации (G18.5), наблюдались ишемические клубочки, о чем свидетельствуют капилляры меньшего диаметра и меньшее количество эритроцитов (рис. 8 C ). и D ). Эти данные показывают, что у мышей Klf17 ^{— / —} развивается ишемия почек во время беременности.

Обсуждение

В этом исследовании мы изучили механизм, лежащий в основе экспрессии корина в беременной матке.Мы определили KLF17 как ключевой фактор транскрипции для экспрессии корина матки во время беременности. Этот вывод подтверждается множеством экспериментальных данных из анализов промотора CORIN и ChIP, профилирования маточного белка Klf у овариэктомированных мышей, получавших прогестерон, и нормальных беременных мышей, нарушения гена KLF17 в HESC и характеристики беременных Klf17 ^{— / —} мышей. Наши результаты показывают KLF17-зависимый транскрипционный механизм экспрессии корина матки, который отличается от опосредованного GATA-4 механизма экспрессии сердечного корина (23).Протеазы, составляющие ~ 2% белков, кодируемых геномом человека (30), имеют большое биологическое значение. Корин представляет собой сериновую протеазу, подобную трипсину, которая, как было показано, обладает такими отчетливыми механизмами транскрипции в определенных тканях.

KLF17 является членом семейства KLF, группы структурно связанных факторов транскрипции, которые действуют в различных тканях, регулируя множество физиологических и патологических процессов (27, 31, 32). Как и все KLF, KLF17 содержит три консервативных C-концевых ДНК-связывающих цинковых пальца, которые распознают последовательности GC-box и CACCC-box (29, 33).По сравнению с другими KLF, KLF17 млекопитающих гораздо менее известен в отношении своей физиологической функции. Большинство исследований KLF17 сосредоточено на его роли в биологии опухолей (34, 35). Подавление KLF17 было идентифицировано при многих раковых заболеваниях человека, включая рак груди, легких, печени и желудка (34, 36–38). Было показано, что KLF17 подавляет эпителиально-мезенхимальный переход и метастазирование рака в трансформирующих сигнальных механизмах, опосредованных факторами роста β и p53 (34, 39, 40).

У рыбок данио и Xenopus ген klf17 экспрессируется в бластуле, невромастах боковой линии и выводных железах (41–43).У курицы эмбриональная экспрессия klf17 была обнаружена в первичной полоске (44). Нарушение гена klf17 у рыбок данио предотвращает вылупление эмбрионов, что приводит к летальному исходу (45). Сходные результаты были обнаружены у эмбрионов Xenopus , когда klf17 , также называемый Nepture , был заблокирован антисмысловыми олигонуклеотидами (46). Эти данные демонстрируют важность klf17 в эмбриогенезе ранних видов позвоночных. В отличие от рыб и Xenopus , у млекопитающих нет выводных желез.У мышей высокие уровни мРНК Klf17 (также называемой Zfp393 ) были обнаружены в сперматидах и развивающихся ооцитах (29). KLF17 Экспрессия мРНК также была обнаружена в семенниках человека (33), что указывает на потенциальную роль KLF17 млекопитающих в гаметогенезе. В нашем исследовании, однако, мы обнаружили, что и самцы, и самки мышей Klf17 ^{— / —} давали жизнеспособное потомство, что указывает на то, что Klf17 не нужен для сперматогенеза и ооцитогенеза у мышей.Более того, мыши Klf17 ^{— / —} и Klf17 ^{+ / +} имели одинаковое количество эмбрионов на уровне G12.5, что указывает на то, что овуляция, оплодотворение и имплантация эмбриона не нарушены Klf17 . дефицит. Мы также наблюдали ожидаемое менделевское соотношение среди потомков от спаривания Klf17 ^+/- , что указывает на то, что Klf17 незаменим в эмбриогенезе.

члена KLF, включая KLF5, KLF9, KLF11 и KLF13, вовлечены в патофизиологию матки (47–52).У людей сверхэкспрессия KLF17 наблюдалась при поздних стадиях рака эндометрия (53). В этом исследовании мы обнаружили неожиданную роль KLF17 в матке беременной. Мы обнаружили, что при стимуляции прогестероном экспрессия KLF17 повышалась в клетках эндометрия матки человека и в матке беременных мышей, что было связано с повышенной экспрессией корина. Соответственно, беременные мыши Klf17 ^{— / —} лишены экспрессии корина матки. У мышей также была отсроченная инвазия трофобластов, плохо ремоделированные маточные спиральные артерии и меньший размер помета, аналогичный фенотип отмечен у мышей с дефицитом корина и ANP (15).Более того, у мышей Klf17 ^{— / —} развилась поздняя гестационная гипертензия и протеинурия, которые также наблюдались у мышей с дефицитом корина и ANP (15). Эти результаты подтверждают решающую роль KLF17 в экспрессии корина и биологии матки. Предполагается, что как фактор транскрипции KLF17 регулирует другие гены в беременной матке. Дальнейшие исследования важны для идентификации этих KLF17-зависимых генов и понимания их роли в регуляции физиологии матки во время беременности.

Таким образом, ремоделирование спиральной артерии матки является физиологическим механизмом беременности. Корин — это протеаза, которая способствует ремоделированию спиральной артерии беременной матки. Низкие уровни мРНК CORIN были идентифицированы у пациентов с преэклампсией (15), что указывает на потенциальную роль дефектной транскрипции CORIN в заболевании. Здесь мы показываем, что KLF17 необходим для активации CORIN в клетках эндометрия матки человека и что дефицит Klf17 устраняет экспрессию Corin в матке у мышей.Наши результаты показывают, что KLF17 является важным фактором транскрипции, который регулирует экспрессию корина и биологию матки во время беременности.

Материалы и методы

Плазмиды.

Плазмида светлячка на основе pGL3 (Promega), содержащая последовательность промотора CORIN человека длиной 405 пар оснований, и плазмида pRL-SV40, экспрессирующая люциферазу Renilla (Promega), были описаны ранее (23). Дополнительные плазмиды с последовательными делециями в промоторной последовательности CORIN получали с помощью сайт-направленного мутагенеза (Agilent Technologies).Плазмиды, экспрессирующие белки KLF2 (RC210042), KLF9 (RC210147), KLF15 (RC207523) и KLF17 (RC208293) человека, были получены от OriGene. Белки KLF, экспрессируемые плазмидами на основе pCMV6, содержали C-концевую метку Myc-DDK (FLAG) для обнаружения белка.

Культура клеток.

Мышиные кардиомиоциты HL-1, первоначально из Уильяма Клейкомба, Медицинский центр Университета штата Луизиана, Новый Орлеан, Лос-Анджелес (без контаминации микоплазмой), культивировали в среде Клейкомба (Sigma) с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 4 мМ л. -глютамин.Клетки аденокарциномы эндометрия матки человека AN3-CA (ATCC HTB-111; профиль короткого тандемного повтора (STR); отсутствие контаминации микоплазмой) и HESC (ATCC CRL-4003; профиль STR; отсутствие контаминации микоплазмой) культивировали, соответственно, в минимальной среде Игла. (MEM) (HyClone, Sh40024.01B) с 10% FBS и средой Eagle, модифицированной Дульбекко (DMEM) / средой Ham’s F-12 (Sigma) с 10% FBS, очищенным от угля и декстрана (Biological Industries), 1,5 г / л бикарбоната натрия и 1% инсулина, трансферрина и селена (Sigma).Клетки культивировали при 37 ° C в увлажненных инкубаторах с 5% CO ₂ .

Двойной репортерный анализ люциферазы.

Люциферазные плазмиды с фрагментами промотора CORIN человека и контрольную плазмиду pGL3 трансфицировали в клетки AN3-CA и HL-1 с помощью реагента Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher). Плазмиду pRL-SV40, экспрессирующую люциферазу Renilla , котрансфицировали в качестве контроля эффективности трансфекции. Через 40 ч при 37 ° C трансфицированные клетки лизировали буфером, предоставленным в наборе Dual-Luciferase Reporter Assay (Promega).Через 15 мин при комнатной температуре добавляли буфер для анализа люциферазы и последовательно измеряли активность люциферазы светлячка и Renilla в ридере для микропланшетов Luminoskan Ascent (Thermo Fisher). Активность промотора CORIN рассчитывали на основании нормализованной активности люциферазы светлячков.

Вестерн-блоттинг рекомбинантных KLF в трансфицированных клетках.

Для исследования влияния экспрессии KLF на активность промотора CORIN плазмиды, экспрессирующие человеческие KLF2, KLF9, KLF15 и KLF17, трансфицировали в клетки AN3-CA и HL-1 липофектамином 2000 (Thermo Fisher).Через 40 ч при 37 ° C клетки лизировали 25 мМ Tris⋅HCl, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, 1% (об. / Об.), Nonidet P-40, 5% (об. / Об.). глицерин и 2% (об. / об.) смесь ингибиторов протеазы (Thermo Fisher, 78442). Белки смешивали с образцом буфера с 2% β-меркаптоэтанолом и анализировали электрофорезом в додецилсульфат / полиакриламидном геле и вестерн-блоттингом с использованием антител против FLAG (Sigma, A8592, 1: 5,000) и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) (Multi Наука Биотех, ab011-04, 0.125 мкг / мл).

HESC.

HESC индуцировали к децидуализации в среде DMEM / F12 с 1 мкМ медроксипрогестерона ацетатом (Sigma), 10 нМ эстрадиолом (Cayman Chemical) и 0,5 мМ 8-бром-цАМФ (Sigma). Клетки с обычной средой DMEM / F12 использовали в качестве контроля. В разные моменты времени клетки лизировали, как описано выше. qRT-PCR (описанная ниже) была проведена для анализа уровней мРНК PRL , кодирующего пролактин (маркер децидуализации), и CORIN .Вестерн-блоттинг использовали для анализа эндогенных белков KLF с использованием антител против KLF2 (Abcam, ab203591, 1 мкг / мл) и KLF17 (Abcam, ab84196, 2 мкг / мл). Относительные уровни белка на рентгеновских пленках, полученных с помощью вестерн-блоттинга, определяли количественно с помощью денситометрии. Для иммуногистохимии ГЭСК на покровных стеклах фиксировали 10% параформальдегидом и иммуноокрашивали антителами против Корина (изготовленных в лаборатории) (15), KLF2 (Abcam, ab203591, 5 мкг / мл) и KLF17 (Abcam, ab84196, 5 мкг / мл). мл) или нормальный IgG (Bioworld Technology, BD0051, 2 мкг / мл), а затем вторичное антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP) (поставляется с набором GTVision, Gene Tech, GK5007).После инкубации при 4 ° C в течение ночи с последующей промывкой добавляли раствор субстрата HRP (3,3′-диаминобензидина) и клетки исследовали под микроскопом (Olympus, DP73). Для иммунофлуоресцентного окрашивания использовали вторичные антитела, конъюгированные с Alexa-488 (зеленый) или 594 (красный) (Invitrogen, A21202 и A11012). Ядра клеток окрашивали DAPI (SouthernBiotech) перед конфокальной микроскопией (Olympus, FV1000).

ОТ-ПЦР и qRT-ПЦР.

Суммарные РНК были выделены из культивируемых клеток или тканей мыши с использованием реагента TRIzol (Invitrogen), набора RNeasy (Qiagen) или набора для выделения высокочистой РНК (Omega Bio-tek) для получения комплементарных ДНК первой цепи (кДНК) с кДНК высокой емкости. Набор для обратной транскрипции (Thermo Fisher).ОТ-ПЦР и qRT-ПЦР проводили с олигонуклеотидными праймерами ( SI Приложение , таблица S1) для генов Corin и Klf s мыши или CORIN и PRL человека. Для qRT-PCR реакцию проводили в 20-мкл смеси с 10 мкл LightCycler SYBR Green Master Mix (Roche, 04707516001), матрицами кДНК (17,5 нг) и олигонуклеотидными праймерами (10 пМ каждый) в 40 циклах. Результаты анализировали с помощью программного обеспечения LightCycler 480 (Roche). Относительные уровни мРНК были рассчитаны с использованием значений гена GAPDH или Gapdh в качестве эталона.

ЧИП.

ChIP получали с использованием набора SimpleChIP Plus Enzymatic Chromatin IP (Cell Signaling Technology). Неиндуцированные и индуцированные HESC обрабатывали 1% формальдегидом в течение 10 мин при комнатной температуре и лизировали в буфере, содержащем дитиотреитол и ингибиторы протеаз. Лизаты обрабатывали микрококковой нуклеазой для получения фрагментов хроматина для иммунопреципитации с помощью магнитных шариков и антител против KLF2 (Abcam, ab203591, 1 мкг), KLF9 (Abcam, ab26076, 1 мкг), KLF17 (Abcam, ab84196, 1 ​​мкг) и Гистон 3 (h4) (поставляется с набором ChIP, 10 мкл) (положительный контроль) или нормальный IgG (Bioworld Technology, BD0051, 1 мкг) (отрицательный контроль).Связанные хроматины элюировали с шариков. ДНК разделяли нагреванием, очищали на спин-колонке и использовали для ПЦР и кПЦР с праймерами для сайта KLF в промоторе CORIN (5′-GGA GGA TCT GTC ATT ACG GGT T-3 ‘и 5’-CAA GCT CAA GAG AGA CAA ACT GAA C-3 ‘) или не-KLF сайт (5′-CGG AGG ATC TGT CAT TAC GGG-3′ и 5’-CTG CTC TAC AGA TCC CAC CC-3 ‘).

Три пары малых направляющих РНК (sgRNA), нацеленных на ген KLF17 (экзон 1), были разработаны с помощью онлайн-инструментов на веб-сайте CRISPR / Cas9 (https: // wge.stemcell.sanger.ac.uk//find_crisprs). Праймеры — направляющая РНК (пРНК) -K LF17 -1F (5′-CAC CGG CTG AGA TGG AAC AGG AGG CT-3 ‘), gRNA- KLF17 -1R (5′-AAA CAG CCT CCT GTT CCA TCT CAG CC-3 ‘), gRNA- KLF17 -2F (5′-CAC CGG GTC CCC TTT GGT GTC TGT TG -3′), gRNA- KLF17 -2R (5′-AAA CCA ACA GAC ACC AAA GGG GAC CC-3 ‘), gRNA- KLF17 -3F (5′-CAC CGG AGA GAT GCT GGG GTC CCC TT-3′) и gRNA- KLF17 -3R (5′-AAA CAA GGG GAC CCC AGC ATC TCT CC-3 ‘) — отжигали и клонировали в плазмиду PX458 (Addgene), экспрессирующую Cas9-sgRNA, для трансфекции в HESC.Клетки, экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок (индикатор), выбранные с помощью проточной цитометрии, выращивали в отдельных колониях после ограничивающего разведения и проверки с помощью ПЦР с последующим секвенированием ДНК и вестерн-блоттингом для нокаута KLF17 .

Исследования на мышах.

Эксперименты с участием мышей были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Университета Сучжоу и проводились в соответствии с руководящими принципами этического обращения и обращения с животными в исследованиях.Мышей содержали в комнатах с регулируемой температурой с 12-часовым / 12-часовым циклом свет-темнота и кормили стандартной диетой для грызунов и неограниченным доступом к воде. Размер выборки был основан на пилотных и опубликованных сопоставимых исследованиях. Исследователи, проводившие эксперименты, не знали генотипов мышей.

Овариэктомия была выполнена анестезированным самкам C57BL / 6 (в возрасте от 8 до 10 недель). Через 9 дней выздоровления мышей случайным образом разделили на три группы для подкожной инъекции кунжутного масла (носитель) (100 мкл), эстрадиола (Cayman Chemical) (50 нг в 100 мкл кунжутного масла) или прогестерона (Sigma) ( 1 мг в 100 мкл кунжутного масла) соответственно.Через 3 дня ежедневной инъекции мышей умерщвляли и выделяли ткани матки для анализа экспрессии генов. Параллельно самок C57BL / 6 (в возрасте от 8 до 10 недель) вязали с самцами C57BL / 6 (в возрасте от 8 до 10 недель) и проверяли на наличие вагинальных пробок. День, когда наблюдалась вагинальная пробка, был определен как G0,5 дня. В разные дни G матки и эмбрионы выделяли для анализа генов, белков и тканей.

Поколение

Эмбриональные стволовые клетки мыши (идентификатор клона: EPD0099_1_D12) были созданы в Wellcome Trust Sanger Institute, чтобы иметь нарушенный аллель Klf17 ( Klf17 ^{tm1a (KOMP) Wtsi} ) с неокассетой и фланкирующими сайтами loxP. экзон 2.Клетки использовали для инъекции бластоцисты для получения химерных и последующих мышей Klf17 ^{+ / tm1a} на фоне C57BL / 6. Генотипирование проводили с помощью ПЦР с праймерами Klf17 -F (5′-GGT TTC TTT CTG TAA TCC TGG CTA T-3 ‘) и Klf17 -KO-R (5′-CAC AAC GGG TTC TTC TGT TAG TC- 3 ‘) или Klf17 -WT-R (5′-TGC CAT AAC ACT GGT AAA CAA CC-3′). Klf17 ^{+ / tm1a} мышей были выведены для получения Klf17 ^{+ / +} , Klf17 ^{+ / tm1a} и Klf17 ^{tm1a / tm1a дальнейшие анализы. Klf17 + / tm1a и Klf17 tm1a / tm1a мыши обозначаются как Klf17 +/− и Klf17 — / — мыши соответственно , в этом исследовании.}

Измерение артериального давления.

Кровяное давление у мышей измеряли с помощью компьютеризированной неинвазивной фотоэлектрической системы «хвост-манжета» (BP-2000, Visitech Systems). Мышей помещали на предварительно нагретую платформу для образцов под крышкой с хвостами в манжете, что позволяло им адаптироваться к устройству и окружающей среде помещения.Каждый тренировочный забег длился не более 30 мин. Через 3 дня акклиматизации, которая проводилась в одно и то же время дня одними и теми же специалистами, было измерено систолическое артериальное давление. Каждое измерение включало 5 циклов предварительной подготовки и 20 регулярных циклов с 5 с между двумя циклами и максимальным давлением в манжете 150 мм рт. Регистрировали средние значения артериального давления.

Мочевые белки.

Образцы мочи были собраны у небеременных и беременных (G12.5 и G18.5) мышей. Уровни белка в моче измеряли с помощью колориметрического анализа Брэдфорда (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, C035-2) и бычьего сывороточного альбумина в качестве эталонного стандарта.

Гистология тканей, иммуногистохимия и вестерн-блоттинг.

Ткани мыши фиксировали 4% (об. / Об.) Формалином и заливали парафином. Срезы (толщиной 5 мкм) вырезали и помещали на покрытые желатином предметные стекла. Серийные срезы использовали для окрашивания гематоксилином и эозином (H&E), PAS и трихромом Массона или иммуногистохимии на основе опубликованных методов (8, 15). Использовали антитела против цитокератина 18 (Abcam, ab181597, 1,25 мкг / мл) и SMA (Abcam, ab5694, 1 мкг / мл) или нормального IgG (Bioworld Technology, BD0051) (отрицательный контроль).Для обнаружения использовали конъюгированные с HRP вторичные антитела (поставляемые с набором MaxVision, набор-5005, Maxim Biotechnologies). Окрашенные срезы исследовали под микроскопом (Leica DM2000 LED). Для вестерн-блоттинга образцы матки и контрольного сердца и печени гомогенизировали в лизирующем растворе (25). Уровни белка определяли количественно с использованием анализа бицинхониновой кислоты (Thermo Scientific, 23227). Вестерн-блоттинг проводили с использованием первичных антител против Klf17 (Abcam, ab84196, 1: 500) и корина (15) (1: 1000) и вторичного антитела, конъюгированного с HRP (Bioworld Technology, bs13278, 1: 10000).В этих экспериментах рекомбинантный KLF17 и корин, экспрессируемые в клетках HEK293, использовали в качестве положительного контроля. GAPDH использовался в качестве контроля загрузки.

Для иммуногистохимического анализа инвазии трофобластов использовали ткани не менее пяти мышей на группу и не менее двух участков имплантации на мышь. Были подготовлены серийные срезы (> 40 на эмбрион). Положение материнской артерии использовалось в качестве ориентира для ориентации сечения. Стекла, окрашенные цитокератином 18, независимо исследовали два человека.Срезы с наиболее глубокой инвазией трофобластов представлены на рис. 7. Для гистологии клубочков срезы почек окрашивали PAS и трихромом Массона. На окрашенных трихромом срезах Массона эритроциты в клубочках подсчитывали под микроскопом два человека слепым методом. В каждую исследовательскую группу входило не менее трех мышей. Данные были получены по крайней мере из пяти случайно выбранных полей в по крайней мере трех разделах от каждой мыши.

Статистический анализ.

Анализ был выполнен с помощью Prism 7 (Graphpad).Различия анализировали с помощью двустороннего критерия Стьюдента t для сравнения двух групп или ANOVA с последующим апостериорным анализом Тьюки для сравнения трех или более групп. P Значения <0,05 считались статистически значимыми. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение или стандартная ошибка среднего, как указано.

Заявление о доступности данных.

Все данные, описанные в статье, представлены в основном тексте SI или приложении .

Благодарности

Мы благодарим Junliang Pan за помощь в анализе промотора гена.Эта работа была частично поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (81873840, 81671485, 81570457 и 31500636), Национальной программы фундаментальных исследований Китая (2015CB2) и приоритетной академической программы развития институтов высшего образования Цзянсу. Производство мышей поддержано грантом Министерства науки и технологий Китая (2018YFA0801100).

Сноски

• Вклад авторов: C.W., Z.W., N.D. и Q.W.спланированное исследование; C.W., Z.W., M.H., T.Z., Y.N., S.S., H.L., C.Z., S.Z. и M.L. проведенное исследование; Y.X. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; C.W., Z.W., M.H., T.Z., Y.N., S.S., H.L., M.L., Y.X., N.D. и Q.W. проанализированные данные; и C.W., N.D. и Q.W. написал газету.

  No related posts.