Пцр реакция это: Сдать анализ крови на ПЦР в Выборгском районе СПб — КФС Отзывы — Корректор функционального состояния.Центр Регион

Содержание

ru:about:media:2019:20202401 [Институт химической биологии и фундаментальной медицины]

ТАСС

от 24.01.2020 г.

Оригинал статьи

Эксперт рассказала, как в России проводят диагностику нового типа коронавируса

МОСКВА, 24 января. /ТАСС/. Диагностику нового типа коронавируса в РФ в связи с отсутствием специальных тестов сегодня проводят традиционным методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), сообщила журналистам в пятницу заместитель директора по научной работе Научно-исследовательского института гриппа Минздрава РФ (Санкт-Петербург), кандидат биологических наук Дарья Даниленко. По словам опрошенных ТАСС ученых, такая диагностика может занимать от нескольких часов до 2 дней.

Полимеразная цепная реакция — экспериментальный метод, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определенных фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале.

«Есть более традиционные, пускай и долгие, методы диагностики, которые очень точно позволяют установить наличие коронавируса.

<…> Это метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим секвенированием. Это сложный метод, такие исследования проводят специализированные лаборатории, и не все больницы способны проводить такие исследования», — отметила Даниленко.

Сколько длится исследование

Как пояснила ТАСС главный инфекционист Новосибирской области Лариса Позднякова (в Новосибирске расположены уникальные учреждения, ориентированные на разработку и внедрение вакцин и лекарств, в частности Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»), максимальное время диагностики таким методом — до двух суток.

«Время диагностики вируса методом ПЦР зависит от тест-системы, которая используется. Иногда анализ может занимать четыре-восемь часов, максимальное время диагностики — двое суток, но обычно результат готов в течение одних суток», — отметила Позднякова.

Тест-систем, которые позволяют быстро выявлять новый тип коронавируса, в течение нескольких минут, на данный момент нет. Однако эксперты отмечают, что в современных условиях разработать их несложно.

«На самом деле, проблем диагностики нет, системы есть, но, может, они существуют не в таком массовом масштабе, потому что ранее коронавирусная инфекция все-таки больше циркулировала среди животных, и вот только относительно недавно стало известно, что она передается человеку, поэтому ту систему, которая определяет коронавирус, нет проблем сделать. Они есть, их просто нужно массово масштабировать», — уверена Позднякова.

Особенности лечения

На данный момент не существует и специальных противовирусных препаратов, направленных непосредственно на возбудителей нового типа коронавируса. В то же время, по словам Даниленко, лечить зараженных новым типом коронавируса можно.

«Лечение понятно, потому что есть протокол ВОЗ, пациент будет изолирован и дальше в зависимости от тяжести и течения инфекции у него будет противовирусное профилактическое лечение. Но специализированных противовирусных препаратов против коронавируса пока нет», — отметила эксперт, добавив, что большинство пациентов, у которых инфекция была лабораторно подтверждена, выздоравливает.

Летальные исходы, как правило, связаны с сопутствующими болезнями зараженных.

«У ряда людей с ослабленным иммунитетом может наблюдаться тяжелое течение болезни. Большинство летальных исходов связаны с тем, что у пациентов были какие-то сопутствующие заболевания, достаточно тяжелые, до того, как они заболели новым возбудителем», — отметила Даниленко.

Опасность коронавирусной инфекции в том, что осложнением является вирусная пневмония, она отличается от бактериальной, поясняет Позднякова. «У нее очень быстрое развитие, она имеет специфическую картину», — отмечает эксперт.

Вакцина от коронавируса

Чтобы разработать вакцину от нового типа коронавируса, может понадобиться несколько лет. «Должно быть проведено серьезно исследование коронавирусов. Такие исследования занимают несколько лет. <…> Это три-пять лет. Но даже разработав такой потенциально профилактический или потенциально терапевтический препарат, потребуются годы на проведение клинических исследований», — считает заведующая лабораторией молекулярной микробиологии Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН Нина Тикунова.

Она не сомневается, что российские ученые справятся с этой задачей. В то же время Позднякова отмечает, что вирус может отступить и без вакцины. «Вирус тоже имеет свои циклические законы, поэтому на смену пиковым значениям активности, безусловно, будет и спад инфекции через 3-6 недель, но это закономерный биологический процесс. Естественно, будет снижение, даже без участия вакцинации», — подчеркнула эксперт.

Генетические тесты

Заведующий лабораторией геномной инженерии МФТИ Павел Волчков при этом рассказал, что генетические тесты на базе ПЦР, разработанные в России и Китае, могут находить даже самые незаметные следы нового коронавируса 2019-nCoV всего за три-пять часов, они станут главным инструментом для оценки масштабов распространения инфекции.

«По сравнению со вспышками лихорадки Эбола, в случае с коронавирусом сложность его обнаружения состоит в том, что порождаемые им симптомы схожи с ОРВИ, например, с гриппом. Выявить ложно позитивных-пациентов поможет молекулярно-генетическое тестирование», — сказал Волчков.

Такие системы, как отметил биолог, уже были созданы и развернуты профильными органами Китая, России и других стран. Они основываются на базе так называемой полимеразной цепной реакции (ПЦР).

«Это самый простой и быстрый по ответу тест, который можно создать. Образцом для него может служить сыворотка крови или любые другие физиологические жидкости, например, соскоб со слизистой, слюна. Из них выделяют РНК, производят реакцию обратной транскрипции, чтобы получить ДНК, и используют ее для размножения фрагментов генома вируса с помощью фермента-полимеразы», — пояснил ученый.

Сейчас, как отметил Волчков, медики оценивают масштабы распространения различных опасных инфекций, в том числе птичьего гриппа или лихорадки Эбола, используя инфракрасные камеры и другие системы наблюдений, позволяющие отслеживать внешние симптомы болезни. В случае с коронавирусом 2019-nCoV, для которого характерен длительный инкубационный период и «заурядный» характер течения болезни, схожий с гриппом, сделать это достаточно затруднительно, особенно до того, как его носитель уже успеет вступить в контакт с другими людьми.

«ПЦР-диагностика пока остается самым быстрым способом обнаружения коронавируса. Она позволяет детектировать ничтожные его количества в физиологических жидкостях за очень короткое время. С другой стороны, симптомы могут проявляться не у всех носителей коронавируса из-за инкубационного периода длиной в несколько дней. Поэтому если выяснится, что на борту самолета летел инфицированный пассажир, и его диагноз подтвердится, то в карантин попадут все его попутчики», — подытожил ученый.

Что такое ПЦР-анализ?

Что такое ПЦР-анализ?

ПЦР — это метод лабораторной диагностики, направленный на выявление возбудителей инфекционных заболеваний. Трёхбуквенный вариант — это аббревиатура названия «полимеразная цепная реакция». Собственно, в этом названии и отражается суть метода, но для того, чтобы разобраться, придётся основательно вспомнить школьный курс биологии.

Но сначала – немного истории. Метод ПЦР был разработан в 1983 году Кэри Мюллисом, за что он был удостоен Нобелевской премии.

Изначально метод использовался в основном для научных целей, но затем, разглядев его перспективность и эффективность, метод стали продвигать в практическую медицину.

В литературе очень часто встречается такое образное описание ПЦР: это метод, с помощью которого учёные могут находить иглу в стоге сена и затем строить стог из этих игл. В принципе, очень точное описание. Если продолжать сравнение, то игла – это небольшой участок генетического материала микроорганизма, а стог сена – это организм человека, в котором данный микроорганизм поселился.

Что показывает анализ ПЦР

Анализ позволяет обнаружить присутствие генетического материала инфекционных возбудителей. ПЦР в гинекологии и в урологии широко применяется для выявления скрытых и труднодиагностируемых инфекций. В том числе выполняется ПЦР и на ВИЧ.

Принцип работы

За генетическую информацию в живом организме любого размера отвечает ДНК — двухспиральная дезоксирибонуклеиновая кислота, состоящая из последовательности четырех нуклеотидов, которые принято обозначать буквами А (аденин), Г (гуанин), Т (тимидин) и Ц (цитозин). Одно из основных правил генетики – правило комплементарности, то есть нуклеотиды соседних спиралей ДНК соединяются только в определеном порядке: А с Т, Г с Ц, и никак иначе.

У каждого живого создания (бактерия, вирус, рыба, зверь) – своя ДНК, причём для выявления конкретного организма достаточно иметь лишь небольшой участок этого хранилища генетической информации. Некоторые виды микроорганизмов, например, вирус иммунодефицита человека, хранят генетическую информацию в другой нуклеиновой кислоте – РНК, но и её фрагменты можно находить с помощью ПЦР.

Именно на обнаружении этого небольшого, но уникального для каждого отдельного организма участка и построен принцип ПЦР. Для каждого возбудителя создан свой специфический генетический детектор, эталонный фрагмент ДНК, который по принципу комплементарности точно обнаруживает «свой» фрагмент ДНК и запускает реакцию создания огромного количества его копий.

Один цикл ПЦР длится около трёх минут, количество копий растёт в геометрической прогрессии. Таким образом, за несколько часов количество фрагментов увеличивается в несколько миллиардов раз. Понятно, что теперь определить, какой возбудитель у данной конкретной инфекции, достаточно легко.

Достоинства

Теория – это, безусловно, замечательно, но что мы имеем на выходе? Какую практическую выгоду получает человек, когда отправляется на поиски вредоносных микроорганизмов, вооруженный ПЦР?

Безусловно, одно из главных достоинств — это универсальностьметода. ПЦР позволяет обнаруживать любые ДНК и РНК, даже когда бессильны другие методы. Оборудование, используемое для ПЦР, стандартно, оно не зависит от того, что именно и где именно мы ищем.
Следующий плюс — высокая специфичность. В материале, направленном на исследование, определяется уникальная последовательность нуклеотидов, характерная только для конкретного возбудителя. Таким образом, можно говорить, что специфичность метода достигает 100%. Кроме того, это позволяет одновременно, в одном и том же материале, проводить поиск нескольких возбудителей без какого-либо ущерба для качества ответа.
Метод обладает высочайшей чувствительностью – мы уже говорили о том, что возможно найти всего один фрагмент генетического материала возбудителя.
Несомненное преимущество метода – оперативность. Постановка реакции занимает несколько часов, таким образом, вся диагностика, от момента сдачи материала на анализ до получения результата, отнимет всего один день.
При помощи ПЦР определяют возбудителя , а не реакцию на его внедрение со стороны организма. Таким образом, появилась возможность точно диагностировать заболевание еще в инкубационном периоде, когда нет никаких клинических или лабораторных признаков болезни.

сферы применения, подготовка к исследованию, анализы на инфекции

Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) – это одно из самых ярких достижений в сфере молекулярной биологии. Метод получил широчайшее распространение в разных областях науки. Благодаря очень высокой специфичности и чувствительности, метод ПЦР применяется в медицине, биологии, ветеринарии, криминалистике, санитарной службе и других отраслях деятельности человека.
Для анализа методом ПЦР можно использовать любые биологические материалы, которые содержат нуклеиновые кислоты (молекулу ДНК или РНК).

Принцип ПЦР- исследования

У каждого живого существа, по крайней мере, на нашей планете, есть уникальный «отпечаток» — ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота), которая отвечает за передачу наследственных факторов от предков к потомкам. Структурно эта молекула представляет собой две нити из молекул-азотитых оснований, удерживаемые рядом друг с другом химическими связями и скрученные в спираль (считается, что для компактности). Из курса биологии вы можете помнить такие названия, как аденин (А), гуанин (Г), тимидин (Т) и цитозин (ц). Это 4 нуклеотида, которые и создают последовательность ДНК. Вирусы хранят свою генетическую информацию в другой нуклеиновой кислоте – РНК.
Информация об уже изученных ДНК и РНК хранится в научных базах лабораторий. После того, как был изобретен метод ПЦР, для многих возбудителей различных заболеваний (бактерии, грибки и вирусы) были созданы свои специфические генетические детекторы (праймеры) — уникальные последовательности нуклеотидов, характерных только для конкретного возбудителя. И если поместить их в пробирку с исследуемым материалом, при наличии в нем ДНК или РНК «живых» возбудителей, праймеры запускают реакцию репликации – создания огромного числа копий, которое можно идентифицировать визуально. Т.е. они начинают копировать свою ДНК/РНК десятки раз.
И при подсчете результатов сотрудники лаборатории могут понять, есть ли искомые бактерии и вирусы в исследуемом образце, или нет, именно поэтому результаты ПЦР чаще всего качественные, т.е. «обнаружено» или «не обнаружено».

Кому мы обязаны появлением метода ПЦР?

Со слов американского биохимика Керри Мюллиса (Kary Mullis), идея идентифицировать живые организмы по короткому участку их генетического кода (ДНК) пришла ему в голову в 1983 году, по пути с работы домой. А в основе этой идеи, лежала работа другого американского биохимика, Артура Корнберга (Arthur Kornberg), которая в свое время не нашла отклика у научного сообщества.

Керри допустил возможность того, чтобы взять молекулу ДНК какого-либо организма, с помощью высокой температуры «распустить» ее спираль на две нити, специфическими маркерами-праймеры пометить уникальные для этого микроорганизма участки ДНК и затем, применив фермент ДНК-полимеразу, создать из двух нитей две новые молекулы ДНК. Но уже содержащие в себе меченные праймеры. И потом останется просто искать эти участки в диагностическом материале.

В итоге, корпорация CETUS, в которой работал Мюлис, выделила ему команду ученых. И в 1985 году, в издании Американского общества генетики человека, появилась публикация с теоретическим обоснованием ПЦР, как метода идентификации генетического материала живых организмов.

Как это все происходит в лаборатории

Выделение ДНК

Сначала пробу биологического материала подготавливают: центрифугируют, осаждают и т.д. Затем лаборантам необходимо выделить ДНК из полученного биологического концентрата.
Амплификация (увеличение числа копий ДНК)
Важнейший этап исследования. Проводится в термоциклере и именно здесь проходят все процессы, подпадающие под определение полимеразно-цепная реакция: денатурация, отжиг, элонгация.
Денатурация
Самый первый этап – развернуть (денатурировать) нуклеиновые кислоты, чтоб сделать их доступными для дальнейшей работы. Осуществляется путем нагрева реакционной смеси до 80-90 °C.
Отжиг
Денатурированные (распущенные) ДНК/РНК обрабатывают праймерами — изготовленными в лабораторных условиях коротенькими цепочками нуклеиновых кислот. Благодаря запрограммированному участку, праймеры прикрепляются только к тем нуклеиновым кислотам, для которых были созданы. Например, праймер для вируса простого герпеса 1 типа, никогда не свяжется с ДНК другого вируса, микроорганизма или клетки.
Именно праймеры обусловливают крайне высокую специфичность ПЦР – способность реагировать только на нуклеиновые молекулы конкретных типов, видов классов и даже штаммов микроорганизмов. Или отдельные виды клеток живых организмов.

Элонгация

Или синтез. После завершения процесса отжига, в реакционной смеси создают условия для активности полимеразы. Фермент, ориентируясь на молекулы праймеров (а не исходных нуклеиновых кислот), начинает синтез новых ниток ДНК/РНК. Которые становятся копиями исходных, искомых молекул нуклеиновых кислот.
Такой температурный цикл проводится 30 и более раз. В результате, даже при изначально небольшом количестве искомого генетического материала, в реакционной смеси накапливается значительное число «помеченных» праймерами нуклеиновых кислот (растет экспоненциально, с удвоением при каждом цикле).Обнаружить большие количества ДНК/РНК намного проще, за счет чего реализуется еще одно преимущество ПЦР – высочайшая чувствительность.

Детекция

Оценка результатов ПЦР проводится несколькими путями:

Электрофорез в вязкой среде. Суть в том, что ДНК/РНК заряжены электрически и движутся к одному из электродов. В среду (агар или полиакридный гель) добавляют краситель ДНК (например – бромистый этидий). В процессе сеанса электрофореза, молекулы нуклеиновых кислот движутся и формируют скопления, подкрашенные этидием. Под ультрафиолетом, это выглядит в виде полосок разной толщины и яркости.
Метод гибридизации. Используются праймеры, заранее помеченные люминофором (флуорофором). После нужного числа температурных циклов, применяют специальный прибор – детектор флюоресценции. За счет того, что в образец можно добавлять флуорофоры для разных мишеней (они будут и светиться под ультрафиолетом разным цветом), метод гибридизации подходит для диагностики сразу нескольких мишеней в одном образце.
ПЦР диагностика в реальном времени (real-time PCR). Отличается тем, что детекция проводится прямо в процессе амплификации. Для этого нужны зонды-люминофоры (из предыдущего пункта) и специальные приборы ДНК-амплификаторы. Эти устройства оценивают нарастание яркости люминофора после каждого температурного цикла и впоследствии, вычисляют исходное число искомых нуклеиновых кислот в образце.

Электрофорез и гибридизация подходят только для качественной оценки, то есть дают ответ на вопрос, есть ли в образце искомый материал. ПЦР в реальном времени – единственный доступный метод количественной оценки.

Если мишеней для праймеров в образце не окажется, то температурные циклы пройдут в холостую и при детекции будет получен отрицательный результат.

Преимущества методики ПЦР

Всего разработано более 10 разных методик амплификации, применяемых лабораториями в зависимости от исходных условий и поставленных целей.
Общим для них есть высокая чувствительность (для положительного результата достаточно 40 (!) или менее искомых копий ДНК в 1 мл образца, то есть вероятность ложноотрицательного ответа ничтожно мала. И очень высокая специфичность: вероятность ложноположительного ответа составляет менее 1%.
Но точность результатов сильно зависит от качества сбора диагностического материала, тщательного соблюдения всех технических требований к каждому этапу и качеству оборудования, расходных материалов (буфера, праймеров, раствора для отмывки и т.д.).

Области применения в медицине

В дерматовенерологии ПЦР используют для выявления венерических заболеваний: микоплазменной, хламидийной инфекций, сифилиса, генитального герпеса и др.
Инфекционисты активно используют ПЦР для диагностики туберкулеза, ВИЧ, вирусных гепатитов, герпеса, мононуклеоза, вируса Эпштейн-Барр и др.). А с помощью ПЦР в реальном времени, оценивая вирусную нагрузку, врачи могут составить мнение о динамике заболевания, отклике на лечение, что особенно актуально для пациентов с ВИЧ, принимающих терапию.
Также благодаря ПЦР врачи могут в течение нескольких дней с уверенностью идентифицировать коклюш и паракоклюш, выявить возбудителей эпидемии ОРВИ. Уточняются типы вируса гриппа, циркулирующие на определенной территории, на основании чего появляется возможность разработать эффективную вакцину для каждого сезона гриппа.
В течение суток или быстрее можно установить вид возбудителя кишечной инфекции, а значит – назначить адекватное лечение и обнаружить вероятный источник заражения.
Летом, ПЦР актуальна для диагностики заболеваний, передаваемых иксодовыми клещами: боррелиоза (болезни Лайма), клещевых энцефалитов.
Метод позволяет работать с любым биологическим материалом. Гемотрансмиссивные инфекции (сифилис, ВИЧ, гепатиты, боррелиоз) исследуются по пробе венозной крови или спинномозговой жидкости. Кожные болезни (герпес, грибки) – по соскобу с пораженного участка. Венерические и урологические – по образцу мочи, спермы, влагалищного отделяемого.
Так что в медицине, ПЦР применяется везде, где нужна высокая точность и быстрота получения результатов.

Лабораторные исследования, выполняющиеся методом ПЦР:

пцр диагностика на Инфекции:

Сделать молекулярно-биологические (пцр) исследования в Тюмени, цены

Железнодорожная отделенческая больница в г. Тюмень предлагает пациентам диагностические услуги по молекулярно-биологическим исследованиям биоматериала методом ПЦР.

Суть метода

ПЦР или полимеразная цепная реакция – достаточно новый и эффективный метод. С его помощью достигается существенное увеличение необходимых фрагментов ДНК в биоматериале (в нашем случае – это проба крови). С помощью метода ПЦР диагностируют инфекционные и наследственные заболевания. В научной деятельности метод ПЦР используют для клонирования, установления отцовства, для выделения нового генного материала.

Диагностика с помощью ПЦР позволяет установить даже единственную копию чужеродной ДНК в крови. Так же метод ПЦР отличается специфичностью, т.е. практически не дает ложноположительных результатов.

Подготовка пациента

Кровь на анализ методом ПЦР берут из локтевой вены. Пациенту перед анализом не разрешается завтракать, за 3 дня до исследования рекомендовано исключить из рациона алкогольные напитки.

Перечень анализов

В нашей лаборатории в формате Мультипрайм можно пройти следующие обследования методом ПЦР:

Молекулярно-биологическое исследование на хламидию, уреаплазму, микоплазму.
Молекулярно-биологическое исследование на гарднереллы, лактобациллы (количественное определение), серию флороценоз.
Анализ на трихомониаз, гонорею.

Другие анализы:

Анализы отделяемого из цервикального и мочевого канала, влагалищного отделяемого на вирус герпеса, папиллома вирус, кандиды, микоплазму хоминис, микоплазму гениталиум, хламидии, цитомегаловирус.
Анализы на гепатиты – В, С.

Стоимость на любой вид услуг можно узнать на сайте http://zdnuz.ru/tseny/isledovaniya/.

ЧУЗ «Клиническая больница «РЖД-Медицина» города Тюмень», адрес: Магнитогорская, 8 тел: 8 (3452) 560-150; 8-800-234-31-90

ПЦР — диагностика инфекционных заболеваний

ПЦР — диагностика (полимеразная цепная реакция) — высокоточный метод диагностики многочисленных инфекций, который основывается на исследовании генетического материала человека (ДНК и РНК). В зависимости от цели исследования используются кровь, слюна, мокрота, выделения половых органов и прочее биологические материалы.

ПЦР — анализ

Часто бывает, что различные по своей природе вирусы могу вызывать одинаковые симптомы заболевания. ПЦР анализ позволяет определить наличие возбудителя, даже при минимальном содержании его штаммов в биологическом материале, а в отдельных случаях, выявляет даже единичные клетки вирусов или бактерий. Определяется вирус, природа его появления, устанавливается сила его воздействия на организм и количество имеющихся микробов в организме. Эта информация важна для лечащего врача при выборе лекарственных препаратов и назначении методов лечения.

В настоящее время ПЦР тест позволяет выявлять все известные современной медицине вирусные заболевания. В том числе даже те, которые могут годами «жить» в организме человека и не проявлять себя, ожидая наиболее комфортных условий для своей «работы». Диагностика «растущих» длительное время возбудителей особенно актуальна в гинекологии и урологии.

В медицинской лаборатории «Синэво» можно пройти ПЦР — диагностику по следующим заболеваниям:

Гепатит B и C

Проведение ПЦР — диагностики необходимо здесь в силу того, что вирус гепатитов имеет продолжительный инкубационный период (до 180 дней) и достаточно серьезные последствия, вплоть до летального исхода.

ИППП

Заболевания, передающиеся половым путем: уреплазмол половых органов, хламидиоз, трихомониаз, микоплазмоз. Коварство заключается в том, что симптомы данных заболеваний зачастую на ранних стадиях «стерты». Эта группа заболеваний опасна тем, что может вызвать у женщин бесплодие, оказывает серьезное влияние на течение беременности, увеличивает риск развития рака шейки матки. У мужчин снижается подвижность и жизнеспособность сперматозоидов, вызывая мужское бесплодие, поражается мочеиспускательный канал и развивается простатит. Увеличиваются риски заболевания генитальным герпесом, а так же ВИЧ/СПИД. Пакет 18.1 «Обследование на ИППП».

Сдать анализ рекомендуется и супругам, желающим родить здорового ребенка. Ведь только ПЦР — диагностика позволяет выявить скрытые инфекции в организме и предотвратить их проникновение в организм плода.

Герпес

Опасное и устойчивое заболевание. Зачастую болезнь не системна и протекает долгие годы в неактивном режиме. При этом возможны проявления, похожие на симптомы герпеса. Но истекают они так быстро, что не возможно точно поставить диагноз традиционным способом. Опасность герпеса в том, что он может поражать центральную нервную систему и стать причиной развития менингита и энцефалита. См. услуги ДНК вируса простого герпеса 1-го и 2-го типа (соскоб) и ДНК вируса простого герпеса 1-го и 2-го типа (кровь, качественное определение).

Тест на отцовство

Благодаря ПЦР — диагностике инфекции выявляются на начальном этапе их развития, что способствует скорейшему выздоровлению и предотвращению серьезных осложнений.

ПЦР диагностика на скрытые инфекции

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это современный высокоточный способ диагностики различных инфекций. Причем это могут и скрытые инфекции, протекающие бессимптомно, и заболевания инкубационном периоде.

С помощью метода ПЦР можно обнаружить:

коронавирус
гепатиты C и B
инфекции мочеполовой системы
инфекционный мононуклеоз
туберкулез
сальмонеллез
листериоз, клещевые энцефалиты, болезнь Лайма
цитомегаловирусную инфекцию
папилломавирусную, герпесную инфекции
детские инфекционные болезни: краснуху, паротит, дифтерию, корь
ВИЧ

Биологическим материалом для исследования может служить кровь, моча, мазок из зева, половых органов – в зависимости от заболевания, на которое проводится диагностика.

Как подготовиться

Мазок у женщин

За 2 дня до проведения ПЦР нужно отказаться от спринцеваний и средств интимной гигиены.

За 2 дня до проведения анализа необходимо отказаться от интимной близости.

За неделю до анализа надо перестать принимать любые лекарственные препараты. Если это невозможно, посоветуйтесь с врачом.

В день сдачи анализа ПЦР гигиена половых органов не проводится, это нужно сделать накануне вечером, использовать только теплую воду.

За 2 часа до сдачи анализа нельзя мочиться.

Мазок у мужчин

За 2 дня до обследования нужно воздержаться от половых контактов.

За неделю до анализа надо перестать принимать любые лекарства. Если это невозможно, посоветуйтесь с врачом.

В день сдачи анализа ПЦР гигиена половых органов не проводится, это нужно сделать накануне вечером, используя только теплую воду.

Рекомендуется не мочиться примерно за 2-3 часа до сдачи анализа.

Анализ крови

Оптимальное время для сдачи крови – утро.

Анализ нужно сдавать строго натощак (отказ от пищи – минимум 8 часов). Воду пить можно.

За сутки до анализ ПЦР нужно отказаться от алкоголя, от курения – за час до него.

За неделю до анализа надо перестать принимать любые виды лекарств. Если это невозможно, посоветуйтесь с врачом.

Накануне исследования необходимо исключить эмоциональные и физические перегрузки.

Перед сдачей крови нужно отдохнуть в течение 15-20 минут.

Мазок из зева

За 2-3 дня до анализа отказаться от любых ополаскивателей для полости рта, содержащих антисептики, а также от спреев для горла и мазей, содержащих антибиотики и противомикробные вещества.

За 3 часа до анализа не принимать пищу и не пить никаких напитков, не чистить зубы, не жевать жевательную резинку.

Метод ПЦР диагностики — что показывает ПЦР тест, точность исследования

Полимеразная цепная реакция, ПЦР (англ. — PCR — polymerase chain reaction) не сходит с заголовков статей научных журналов с тех пор, как была открыта Кэри Б. Мюллисом в 1983 году, за что он был удостоен Нобелевской премии.

ПЦР — это метод, который позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой участок генетической информации (ДНК) инфекционного возбудителя и многократно размножить его.

В диагностике инфекций передаваемых половым путем (ИППП) также используются следующие методики:

микроскопия — исследование неокрашенных и окрашенных препаратов в светооптическом микроскопе. Точность метода зависит от опыта врача-лаборанта. Как правило хорошо диагностируются гонококки, трихомонады, гарднереллы и кандиды (бактерии больших размеров). Другие инфекции не видны под микроскопом, так как очень маленького размера.
бактериология — культивирование (выращивание) инфекций на питательных средах. До практического использования ПЦР, бактериальное исследование считалось «золотым стандартом» в диагностике ИППП, т. е. самым точным методом. Большим плюсом данной методики является возможность определения чувствительности микробов к антибиотикам. Минусом — необходимость быстрой доставки клинического материала в лабораторию, пока микробы не погибли в окружающей среде, не все ИППП растут на питательных средах, необходимость использования качественных питательных сред, сроки получения результатов — 5 — 7 дней.
иммуноферментный анализ — определение специфических антител (белков), вырабатываемых в ответ на внедрение микробов (антигенов) в сыворотке крови. То есть выявляют не сам микроб, а антитела которые вырабатывает организме человека. Плюсом метода является возможность определение стадии инфекционного процесса (в острой стадии определяются иммуноглобулины (антитела) класса М, в хронической — иммуноглобулины класса G). Минусом — отсутствие выработки антител у пациентов с иммунодефицитом, перекрестная реакция антител со схожими микробами, низкие показатели чувствительности и специфичности. На основании результатов только ИФА без подтверждения другими методами диагностики и при отсутствии клинических проявлений выставлять диагноз не представляется возможным.

В настоящее время ПЦР является самым точным методом диагностики инфекционных заболеваний. Точность любого метода диагностики в медицине оценивается такими понятиями как чувствительность и специфичность.

Чувствительность — процент положительных результатов среди обследованных инфицированных лиц. Это значит, что при обследовании 100 человек больных хламидиозом методом ПЦР диагноз будет подтвержден у 98-99 человек, а у 1-2 человек из 100 будет установлен ложноотрицательный результат. Чувствительность ИФА в диагностике инфекций передаваемых половым путем — 50-60%. Это значит, что у 40-50 людей из 100 больных хламидиозом возможен ложноотрицательный результат.

Специфичность — процент отрицательных результатов среди обследованных здоровых лиц. Это значит , что при обследовании 100 здоровых людей на хламидии методом ПЦР у 97-98 обследуемых покажет отрицательный результат, а у 2-3 человек возможен ложноположительный результат. Специфичность ИФА составляет 60-70%.

Ниже приведены показатели чувствительности и специфичности методов диагностики инфекций передаваемых половым путем.

Метод диагностики	Чувствительность, %	Специфичность, %
Микроскопия	20 — 60	70 — 80
Бактероилогия	40 — 80	80 — 90
ИФА -серология	50 — 60	60 — 70
ПЦР	98 — 99	97 — 98

Как видно из таблицы метод ПЦР обладает наилучшими результатами в диагностике инфекции передаваемых половым путем. Именно поэтому можно получить разные результаты исследования у одного человека, если он обследован разными методами диагностики. Но приоритет всегда должен отдаваться ПЦР, как самому точному из всех.

На сегодняшний день существует 2 методики ПЦР-анализа: так называемая «форезная» и «ПЦР в реальном времени» (более современная).

Основным приемуществом методики ПЦР в реальном времени по сравнению с форезом является:

сведение к минимуму риска контаминации (загрязнение) лаборатории и связанных с ней ложно-положительных результатов и артефактов ПЦР-анализа
упрощение требований к организации лаборатории — отсутствует необходимость в изолированном дополнительном помещении для проведения этапа детекции и отдельного врача -лаборанта
автоматический анализ результатов с помощью компьютера, стандартизация результатов, исключение субъективности результатов (при форезной методике результат исследования определяется врачем-лаборантом, а при ПЦР в реальном времени — компьютером)
возможность количественной оценки содержания ДНК возбудителя в клиническом образце

Несмотря на высокую точность анализов, не редки случаи получения противоположных результатов в разных ПЦР-лабораториях. Это объясняется многими факторами. Критериями качественной работы лаборатории является:

использование сертифицированных тест — систем, обладающих высокой аналитической чувствительностью
использование внутренних и внешних контролей работы лаборатории
высокая воспроизводимость результатов (95 — 98%)
современное оборудование
квалифицированные специалисты
борьба с контаминацией (загрязнением лаборатории продуктами амплификации)
правильное расположение «рабочих» зон лаборатории
при наличии сомнительных результатов и артефактов ПЦР-анализа — их перестановка на различных этапах
архивирование результатов исследований с возможностью их просмотра в спорных случаях.

Таким образом, только сочетание грамотного специалиста и качественно работающей лаборатории могут обеспечить постановку правильного диагноза и как следствие быстрого и полного выздоровления. Если возникает несоответствие клинической картины с результатами лабораторных исследований, необходимо повторное проведение анализов. Единственное нужно понимать, что подтвердить диагноз, поставленный методом ПЦР, можно только методом ПЦР, выполненным в другой лаборатории или повторно в этой же, так как другие способы диагностики сильно уступают вышеуказанному методу диагностике.

Если вы хотите сдать ПЦР-анализы и получить профессиональную диагностику, то специалисты нашей клиники готовы оказать вам действительно качественные услуги.

Что такое полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Справочная информация

Стандартная полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это метод in vitro , который позволяет многократно копировать одну короткую область молекулы ДНК (возможно, один ген) с помощью полимеразы Taq . Из одной копии ДНК (шаблона) исследователь может создать тысячи идентичных копий, используя простой набор реагентов и базовый цикл нагрева и охлаждения (денатурации и отжига).Процесс стал автоматизированным с открытием термостойкой ДНК-полимеразы термофильной бактерии Thermus aquaticus (Taq) . Полимераза Taq может выдерживать множество циклов нагрева и охлаждения, которые денатурируют ДНК-полимеразы других видов.

В дополнение к матричной ДНК и полимеразе Taq для ПЦР требуются свободные нуклеотиды [dNTP; аденин (A), цитозин (C), гуанин (G), тимин (T)] в равном молярном соотношении.Для этого также требуются два уникальных одноцепочечных олигонуклеотидных (олиго) праймера для ДНК, которые отжигаются с областями выше (5 ’) и ниже (3’) сегмента ДНК, подлежащего амплификации. Когда эти реагенты объединяются в подходящем буфере, серия стадий нагревания (денатурирования) и охлаждения (отжига) позволяет полимеразе Taq копировать ДНК между олигопраймерами. Этот метод молекулярной биологии создает несколько микрограммов целевой ДНК из нескольких нанограмм матричной ДНК с помощью нескольких циклов денатурации, отжига и синтеза.После завершения ПЦР продукт может быть проверен по размеру гель-электрофорез.

Протокол видео

Посмотрите видео с протоколом ниже, чтобы узнать, как проводить полимеразную цепную реакцию (ПЦР).

Базовая программа ПЦР

Начальная денатурация в течение 2 минут при 94 ° C: Эта стадия инициации нагревает двухцепочечную матричную цепь ДНК до точки, когда цепи начинают денатурировать и водородные связи между парами нуклеотидных оснований разрываются.Первоначальный этап денатурации обычно выполняется при 94–98 ° C.
Денатурация 30 секунд при 94 ° C: Продолжающаяся денатурация двухцепочечной ДНК.
Праймеры для отжига в течение 30 секунд при 55 ° C: Прямой и обратный праймеры стабильны в этом диапазоне температур для отжига с каждой из однонитевых цепей матрицы ДНК. ДНК-полимераза также достаточно стабильна, чтобы теперь связываться с последовательностью ДНК праймера.
Удлинение ДНК в течение 1 минуты при 72 ° C: Полимераза Taq имеет оптимальную температуру около 70-75 ° C, поэтому этот этап позволяет ДНК-полимеразе синтезировать и точно и быстро удлинить новую цепь ДНК-мишени.
Повторить шаги 2-4 25-30 раз.
Окончательное удлинение в течение 5 минут при 72 ° C: Окончательное удлинение для заполнения любых выступающих концов вновь синтезированных нитей.

Перечень материалов

Реагенты на каждые 50 мкл ПЦР:

Тонкостенная пробирка для ПЦР
Ведро для льда
2 мкл матричной ДНК (10 нг-500 нг)
5 мкл 10X Taq-буфера с MgCl ₂
1 мкл смеси dNTP (10 мМ каждая н.)
2,5 мкл прямого праймера (запас 10 мкМ)
2,5 мкл обратного праймера (10 мкМ в исходном состоянии)
36.8 мкл стерильно dH ₂ O
0,2 мкл ДНК-полимеразы Taq (5 единиц / мкл)
ПЦР-машина
Агарозный гель

Процедура

Дизайн праймеров и ПЦР

Грунтовки для дизайна. См. Наш протокол о том, как создавать праймеры.
Примечание. Primer3 — отличный ресурс для выбора грунтовок.
Поместите тонкостенные ПЦР-пробирки на лед
Настройте реакцию объемом 50 мкл (держите все реагенты на льду):
Примечание: Если вы проводите несколько ПЦР, сэкономьте время, создав «мастер-микс», который сводит к минимуму количество необходимых вам небольших объемов пипетировать.Если вы используете одну и ту же матричную ДНК для всех своих реакций, матричную ДНК можно добавить в мастер-микс. Прямой и обратный праймеры НЕ добавляют в мастер-микс.
Поместите реакционные пробирки в ПЦР-машину.
Установите температуру отжига на 5 ° C ниже температуры плавления праймера (Tm).
Установите шаг расширения на 1-2 минуты на килобазу продукта в зависимости от того, используете ли вы полимеразу с возможностью корректуры.
Примечание: См. Инструкции производителя для получения конкретных инструкций относительно времени продления и температуры.
Начальная денатурация в течение 2 минут при 94 ° C.
Денатурация в течение 30 секунд при 94 ° C.
Отжиг праймеров в течение 30 секунд при 55 ° C (или на 5 ° C ниже Tm).
Удлините ДНК в течение 2 минут при 72 ° C.
Повторите шаги 8-10 для 25-30 циклов.
Окончательное удлинение в течение 5 минут при 72 ° C.
Выполните 2 мкл геля, чтобы проверить размер и концентрацию продукта ПЦР.

Приготовление мастер-микса

Умножьте объем каждого реагента на количество отдельных ПЦР, которые вы хотите провести, и добавьте 10% дополнительно, чтобы учесть ошибку пипетирования. В этом примере у нас есть 7 различных реакций (7 уникальных пар праймеров), поэтому мы умножаем каждый объем на 7.
В одной пробирке объемом 1,5 мл объедините следующее:
Перемешайте содержимое, осторожно пипетируя несколько раз вверх и вниз. Держите трубку на льду.
Добавьте прямой и обратный праймеры в тонкостенные пробирки для ПЦР.
Примечание: Сделайте это перед добавлением мастер-микса, чтобы вы знали, что праймеры были добавлены, нанесите пипеткой прямой праймер на одну сторону стенки пробирки, а обратный праймер — на другую.
Добавьте мастер-микс в тонкостенные пробирки для ПЦР. Поместите 50 мкл — 2,5 мкл (прямой праймер) — 2,5 мкл (оборотный праймер) = 45 мкл объема мастер-микса для добавления в каждую пробирку для ПЦР.
Прикрепите верхние части к пробиркам для ПЦР, осторожно постучите по каждой пробирке, чтобы вся жидкость опустилась на дно, прежде чем помещать ее в аппарат для ПЦР.

Праймеры для разбавления

Большинство людей заказывают праймеры у компании, которая синтезирует и отправляет их в виде лиофилизированного порошка.Затем исследователь должен восстановить свои праймеры в жидкости, обычно стерильной dH ₂ O. Чтобы получить 100 мкМ любого праймера, добавьте количество мкл dH ₂ O, равное количеству наномолей ДНК, умноженному на 10. Например, если длина вашей лиофилизированной ДНК составляет 38,5 нм, добавьте 385 мкл воды.

После приготовления 100 мкМ массы немедленно сделайте рабочую концентрацию каждого праймера (10 мкМ), разбавив смесь 1:10. Например, добавьте 100 мкл исходного грунтовочного раствора к 900 мкл dH ₂ O.

Советы и часто задаваемые вопросы

Если ваша целевая последовательность ДНК является GC-богатой, увеличьте время денатурирования.
Ваши 5 ’и 3’ грунтовки должны иметь одинаковую температуру плавления (Tm). Установите температуру отжига на 5 ° C ниже, чем Tm ваших праймеров. Если вы получаете неспецифические продукты ПЦР, постепенно увеличивайте температуру отжига на 1-2 ° C.
Скорость синтеза ДНК ~ 1-2 т.п.н. / мин. Время продления можно регулировать в соответствии с длиной целевой последовательности.
Как разработать грунтовки? См. Нашу справочную страницу о том, как создавать праймеры для получения подробных инструкций и ознакомьтесь с нашим протоколом клонирования плазмид с помощью ПЦР, чтобы узнать, как создавать праймеры для целей клонирования.
Что мне делать, если мой ПЦР не работает? Попробуйте добавить 1 мкл 25 мМ MgCl ₂ и / или 1 мкл ДМСО в каждую реакцию.Идеальная установка для этого шага устранения неполадок — выполнить одну реакцию для каждого и одну реакцию для обоих. MgCl ₂ действует как дополнение к количеству, поставляемому буферным раствором, который, как известно, образует градиент при замораживании. ДМСО помогает при денатурации ДНК, особенно для матриц с высоким содержанием ГХ.
Что конкретно делает каждый ингредиент?
ДНК-матрица содержит часть ДНК, которую мы хотим амплифицировать для анализа и манипуляции.Для эффективной работы ПЦР важно, чтобы матричная ДНК и праймер дополняли друг друга.
Taq Буфер с MgCl ₂ обеспечивает оптимальную и стабильную химическую среду для адекватной работы ДНК-полимеразы. Двухвалентные катионы, такие как Mg ²⁺ и Mn ²⁺, стабилизируют буферный раствор. Эти катионы также могут быть использованы для мутагенеза ДНК, опосредованного ПЦР. Более высокая концентрация катионов увеличивает частоту ошибок ДНК-полимеразы.
Дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP) — это строительные блоки, добавляемые по одному к новой цепи ДНК с помощью ДНК-полимеразы.
Прямой и обратный праймеры гибридизуются и комплементарны 3 ’концам смысловой и антисмысловой цепей матричной ДНК. Это нити нуклеиновой кислоты, которые являются отправными точками для удлинения и синтеза ДНК.
Taq ДНК-полимераза — это особая ДНК-полимераза, которая может выдерживать радикальные изменения температуры во время типичной ПЦР.ДНК-полимераза имеет оптимальную температуру около 70 ° C и является молекулой, ответственной за синтез ДНК.
Стерильный dH ₂ O используется для заполнения оставшихся 50 мкл реакционной смеси. Его способности к растворителю и буферу обеспечивают подходящую среду для реакции амплификации ДНК.

Что такое ПЦР? — Руководство для начинающих

ПЦР — это методика современных лабораторий молекулярной биологии.Если вам нужно скопировать, секвенировать или количественно оценить ДНК, вам нужно знать ПЦР. Короче говоря, ПЦР (полимеразная цепная реакция) — это биохимический метод, который использует термоциклирование и ферменты для быстрого и надежного копирования ДНК, и он был изобретен во вспышке вдохновения ученым, проезжающим по шоссе 128 из Сан-Франциско в Мендосино.

В этой статье дается краткий базовый обзор ПЦР с несколькими советами, которые помогут избежать наиболее распространенных ошибок. Если вы новичок или относительно плохо знакомы с ПЦР, то это для вас.(И даже если у вас есть опыт работы с ПЦР, его стоит прочитать, чтобы освежиться, и, возможно, получить пару советов!).

Основные ингредиенты для ПЦР:

Полимераза

Полимеразы — это ферменты, которые в определенных условиях могут собирать новые цепи ДНК из матричной ДНК и нуклеотидов. Первоначальная реакция ПЦР была обременительной, поскольку высокие температуры, необходимые для денатурирования ДНК, убивали бы полимеразы. Это означало, что после каждого цикла нагревания новые полимеразы нужно было вручную добавлять в реакцию — дорогостоящее мероприятие.Однако в современной ПЦР это не проблема, поскольку полимеразы, используемые в современной ПЦР, обычно происходят из одного из двух источников термофильных бактерий: Thermus aquaticus или Pyrococcus furiosus . Эти полимеразы, соответственно Taq (произносится как «липкость») и Pfu (произносится как «P-F-U»), легко выдерживают высокие температуры, связанные с реакцией ПЦР. Коммерческие полимеразы Taq и Pfu разработаны для обеспечения скорости, точности, процессивности (способности выполнять длинные чтения) и их способности читать шаблоны GC-rich.Компании постоянно выпускают новые полимеразы. Поэтому не соглашайтесь на «все, что у вас в морозилке», а выбирайте лучшую коммерческую полимеразу для ваших нужд ПЦР. Также поговорите со своим местным торговым представителем, так как они часто могут выдать бесплатные образцы полимеразы, чтобы вы могли решить, что лучше для вас.

Шаблон ДНК

Это ДНК, для которой вы разрабатываете свои праймеры. Это ДНК, которую ваша полимераза будет читать и копировать. Ваша матричная ДНК может быть геномной, плазмидной или кДНК, но независимо от качества вашего источника.Чем более неповрежденной и чище ваша матричная ДНК, тем легче получить хорошие результаты ПЦР. Также имейте в виду, что идеальное количество ДНК будет зависеть от вашего источника, обычно от 1 до 1 нг плазмидной ДНК или от 1 до 1 мкг геномной ДНК на реакцию ПЦР.

Грунтовки

Праймеры

— это короткие фрагменты синтезированной ДНК, которые связываются с вашей матричной ДНК. Вам нужно будет создать одну «прямую» грунтовку и одну «обратную» грунтовку. Ваш прямой праймер обозначает начало вашей ПЦР. Последовательность этого праймера такая же, как последовательность вашей ДНК-матрицы 5´-3´.Обратный праймер обозначает конец вашей ПЦР. Последовательность этого праймера является обратным комплементом вашей матричной ДНК. Как правило, длина праймеров составляет 18–22 пары оснований. Однако важнее, чем их длина, температура плавления ваших грунтовок. Температура плавления ваших грунтовок должна составлять 54-60 ° C и быть максимально похожей друг на друга. Существует множество онлайн-калькуляторов, которые могут рассчитать температуру отжига праймеров, и большинство компаний, производящих праймеры, предоставляют такие калькуляторы.

Нуклеотиды

Как мономеры ДНК, нуклеотиды необходимы для создания копий ДНК. Для большинства ДНК-ПЦР вы будете использовать дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP). Вы можете купить их отдельно или в виде смеси dGTP, dCTP, dATP и dTTP. Что бы вы ни покупали, имейте в виду, что нуклеотиды очень чувствительны к циклам замораживания / оттаивания. Поэтому лучше всегда создавать небольшие аликвоты ваших dNTP. Также убедитесь, что вы храните их должным образом — не используйте морозильную камеру с функцией автоматического размораживания.

Буфер

Большинство коммерческих полимераз поставляются со своим идеальным буфером. Эти буферы не только обеспечивают правильный pH, но и всегда содержат добавки, такие как магний, калий или ДМСО, которые помогают оптимизировать денатурирующую, ренатурирующую и полимеразную активность ДНК. Подробнее об этих добавках мы поговорим в следующей статье.

Термоциклирование:

Здесь происходит волшебство. Все вышеперечисленные ингредиенты добавляются в пробирку для ПЦР, и пробирка подвергается термоциклированию.Когда впервые была изобретена ПЦР, для достижения термоциклирования отдельные пробирки для ПЦР вручную перемещали между нагретыми водяными банями. (И вы думаете, что ваша работа на скамейке утомительна!) Теперь, благодаря изобретению «Мистер. Cycles », первой машины для термоциклирования, регулирование температуры теперь осуществляется автоматически с помощью термоциклеров. Ниже приведен типичный профиль термоциклера для ПЦР:

1. Инициализация

На этой стадии реакцию нагревают до 94-96 ° C в течение от 30 секунд до нескольких минут.Этот шаг обычно выполняется только один раз в самом начале реакции ПЦР. Этот шаг важен для активации полимераз горячего старта, если вы используете такую полимеразу, и для денатурирования вашей ДНК-матрицы. Имейте в виду, что если содержимое GC в вашем шаблоне велико, вам может потребоваться выполнить очень длинный шаг инициализации.

2. Денатурация (повторение 15-40 раз)

На этой стадии реакцию нагревают до 94-98 ° C в течение 15-30 секунд. Этот шаг денатурирует вашу ДНК и праймеры, что позволит им отжечь друг друга на следующем шаге.

3. Отжиг (15-40 раз)

На этом этапе температура реакции быстро понижается до 50-64 ° C на 20-40 секунд. Температура на этом этапе должна быть достаточно низкой, чтобы денатурированные праймеры могли образовывать пары оснований Ватсона-Крика с ДНК-шаблоном. Но достаточно высокий, чтобы образовываться только наиболее стабильные (идеально спаренные) двухцепочечные структуры ДНК. Обычно эта идеальная температура отжига на несколько градусов ниже температуры плавления пары праймеров.Также на этом этапе ваша полимераза связывается с комплексом ДНК праймер / матрица. Хотя ваша полимераза не начнет считывать, пока температура не будет повышена на следующем шаге.

4. Удлинение или удлинение (повторяется 15-40 раз)

На этом этапе ваша реакция быстро нагревается до 72-80 ° C. Это когда ваша полимераза начнет читать (в направлении 5´-3´) и копировать вашу матричную ДНК (в направлении 3´-5´). Более высокая температура на этом этапе снижает неспецифические взаимодействия праймер / матрица ДНК, тем самым повышая специфичность вашей реакции.Однако точная температура будет зависеть от предпочтений вашей полимеразы, поэтому ознакомьтесь с информацией на упаковке. Продолжительность этого шага зависит от того, какой длины будет ваша копия ДНК. Обычно ДНК-полимераза может копировать 1000 пар оснований в минуту. Таким образом, вам необходимо выделить не менее 1 минуты на продление на 1000 баз. В конце этой инкубации будут созданы новые двухцепочечные фрагменты ДНК, состоящие как из матрицы, так и из новой ДНК.

Шаги 2-4 повторяются 15-40 раз

Это правда, что чем больше циклов вы запрограммируете, тем больше копий ДНК вы создадите.Однако есть верхний предел. В какой-то момент количество доступных свободных нуклеотидов становится ограниченным, и преждевременно усеченные копии ДНК могут стать проблемой. Так что не жадничайте с ездой на велосипеде. Меньше, но хороший чистый продукт ПЦР предпочтительнее большого количества грязного продукта.

5. Окончательное удлинение

Это необязательный, но часто рекомендуемый шаг. На этой стадии реакцию выдерживают при 70-74 ° C в течение нескольких минут. (Обычно вы будете использовать ту же температуру, что и на этапе удлинения или удлинения.Этот шаг позволяет полимеразам завершить чтение той нити, на которой они в настоящее время находятся. Этот необязательный шаг может помочь уменьшить количество усеченных копий в конечном продукте.

6. Финальная задержка

Теперь ваша реакция завершена. Так как весь процесс может занять несколько часов, реакции ПЦР часто проводятся в течение ночи или когда вы отступили; Рекомендуется запрограммировать термоциклер на температуру продукта ПЦР 4 ° C до вашего возвращения. В это время вы можете проанализировать или использовать свой продукт или перенести его в более подходящее место для длительного хранения, например, в холодильник.

Удачи и счастливой ПЦР!

Вам это помогло? Тогда поделитесь, пожалуйста, со своей сетью.

Что такое ПЦР? — Science Learning Hub

ПЦР — это сокращение для простой, но очень полезной процедуры в молекулярной биологии, которая называется олимераза p c hain r eaction . Это метод, используемый для амплификации интересующего сегмента ДНК или получения множества копий.Другими словами, ПЦР позволяет получить миллионы копий определенной последовательности ДНК из изначально небольшого образца — иногда даже одной копии. Это важнейший процесс для ряда генетических технологий, который, по сути, позволил разработать ряд новых технологий.

Как работает ПЦР?

ПЦР имитирует то, что происходит в клетках, когда ДНК копируется (реплицируется) до деления клетки, но ее проводят в контролируемых условиях в лаборатории. Используемая машина называется просто ПЦР-машиной или термоциклером.Пробирки, содержащие интересующую смесь ДНК, помещают в машину, и машина меняет температуру в соответствии с каждым этапом процесса.

Стандартные ингредиенты в смеси:

интересующий сегмент ДНК
специфические праймеры
термостойкий фермент ДНК-полимераза
четыре различных типа нуклеотидов ДНК
соли, необходимые для создания подходящей среды для фермент действовать.

Что такое процесс ПЦР?

Шаг 1. Денатурация

Как и в случае репликации ДНК, две цепи двойной спирали ДНК необходимо разделить.

Разделение происходит за счет повышения температуры смеси, в результате чего водородные связи между комплементарными цепями ДНК разрываются. Этот процесс называется денатурацией.

Этап 2: Отжиг

Праймеры связываются с целевыми последовательностями ДНК и инициируют полимеризацию. Это может произойти только после того, как температура раствора будет понижена. С каждой нитью связывается один праймер.

Шаг 3. Расширение

Новые цепи ДНК создаются с использованием исходных цепей в качестве шаблонов.Фермент ДНК-полимераза объединяет свободные нуклеотиды ДНК. Этот фермент часто представляет собой Taq-полимеразу, фермент, первоначально выделенный из термофильных бактерий, называемых Thermus aquaticus. Порядок добавления свободных нуклеотидов определяется последовательностью нуклеотидов в исходной (матричной) цепи ДНК.

Результатом одного цикла ПЦР являются две двухцепочечные последовательности целевой ДНК, каждая из которых содержит одну новую цепь и одну исходную цепь.

Цикл повторяется много раз (обычно 20–30), поскольку для большинства процессов с использованием ПЦР требуется большое количество ДНК.Чтобы получить около миллиарда копий, нужно всего 2–3 часа.

Технология ПЦР все еще развивается. Постоянно совершенствуются и совершенствуются используемые процессы и инструменты, позволяющие адаптировать процесс к потребностям специалистов. Например, разрабатываются и используются новые методы и усовершенствования, особенно когда требуется количественное определение ДНК в образце. Новые методы включают ПЦР в реальном времени или количественную ПЦР (qPCR) и цифровую PCR (dPCR). В кПЦР амплификация ДНК отслеживается в режиме реального времени, что позволяет количественно определять целевую ДНК на протяжении всего процесса.ЦПЦР — это новый, более совершенный подход, который разбивает процесс ПЦР на множество более мелких этапов. Он предлагает повышенную точность, более надежные измерения и абсолютный количественный анализ очень маленьких или смешанных образцов.

Природа науки

Развитие новых технологий, таких как ПЦР, позволяет делать новые открытия. Также могут быть разработаны другие технологии. См. Для чего используется ПЦР? для некоторых примеров того, как используется ПЦР, и различных типов исследований и процессов, которые возможны благодаря этому.

Полимеразная цепная реакция — обзор

Что означает ПЦР? Кто это придумал?

Каков основной принцип ПЦР?

Назовите различные компоненты, необходимые для ПЦР.

Какой фермент используется в ПЦР? Объясните, почему этот фермент используется для реакции.

Какие этапы включают один цикл реакции ПЦР?

Что такое T _m? Почему это значение важно для ПЦР?

Опишите, какие типы параметров используются для расчета T _m грунтовки.

Что такое ошибочная заправка? Что может вызвать ошибочный старт в ПЦР?

Что такое вырожденные праймеры? Назовите два варианта использования вырожденных праймеров.

10.

Какие изменения в стандартной ПЦР сделаны для ПЦР на больших расстояниях?

11.

Опишите ПЦР с горячим стартом. Какие две общие модификации сохраняют полимеразу Taq неактивной до стадии денатурации первого цикла ПЦР?

12.

Что такое обратная транскриптаза?

13.

Что такое кДНК? Как они сделаны?

14.

Каковы различные варианты использования ОТ-ПЦР?

15.

Назовите три различных типа праймеров, которые можно использовать для реакции обратной транскриптазы? В чем преимущества и недостатки каждого типа грунтовки?

16.

Опишите, как SYBR Green I можно было бы использовать в кПЦР для оценки количества продукта ПЦР.

17.

Опишите, как 5 ’нуклеазный зонд используется в кПЦР для оценки количества продукта ПЦР.

18.

Объясните, как использование 5’-нуклеазного зонда может обеспечить большую специфичность во время кПЦР.

19.

Почему трудно получить полноразмерную кДНК с использованием обратной транскриптазы?

20.

Каковы два способа изменения оснований ДНК с помощью ПЦР?

21.

Какие этапы включают вставку или удаление ДНК с помощью ПЦР?

22.

Что такое мультиплексный КПЦР? Как проходит эта процедура?

23.

Назовите два применения ПЦР в медицинской диагностике.

24.

Каковы преимущества ПЦР-анализа в окружающей среде?

5′-зонд нуклеазы

Зонд, используемый для определения относительного количества продуктов ПЦР, образующихся в каждом цикле количественной ПЦР (кПЦР).Зонд имеет флуорофор на 5′-конце и гаситель на 3′-конце, который предотвращает испускание флуоресцентного света до тех пор, пока он не разложится ДНК-полимеразой.

отжиг

(в ПЦР) Второй этап каждого цикла ПЦР, на котором температура термоциклера позволяет образовывать водородные связи между праймером ПЦР и его комплементарной целевой ДНК.

последовательность штрих-кода

Уникальная последовательность, добавленная в кассету для маркировки гена меткой для последующего анализа.

биомаркер

Измеримое вещество, обнаруженное в крови и т. Д., Которое указывает тип и / или тяжесть заболевания.

циркулирующая опухолевая ДНК (ктДНК)

Фрагменты ДНК, обнаруженные в крови от умирающих опухолевых клеток. Количество ctDNA увеличивается с тяжестью рака и является хорошим биомаркером для определения типа и стадии рака.

комплементарная ДНК (кДНК)

Вариант гена, в котором отсутствуют интроны и который сделан из соответствующей мРНК с использованием обратной транскриптазы.

вырожденный праймер

Праймеры, сконструированные так, чтобы иметь более одного возможного основания в определенных положениях в последовательности. После синтеза появляются разные праймеры, некоторые из них будут иметь одно из возможных оснований, а другие праймеры будут иметь альтернативные основания.

денатурация

(в ПЦР) Первый этап каждого цикла ПЦР, на котором температура термоциклера достаточно высока для «плавления» водородных связей, удерживающих вместе двухцепочечную ДНК, и в результате получается одноцепочечная ДНК.

направленный мутагенез

Преднамеренное изменение последовательности ДНК гена с помощью любого из множества искусственных методов.

удлинение

(в ПЦР) Третий этап каждого цикла ПЦР, на котором температура термоциклера устанавливается на оптимальную температуру для термостабильной ДНК-полимеразы для удлинения или удлинения праймера ПЦР, создавая копию целевой ДНК.

ДНК из окружающей среды (eDNA)

ДНК, собранная из окружающей среды, которая содержит очень сложную смесь фрагментов ДНК от любого существующего или, возможно, даже недавно прошедшего через место отбора проб организма.

extension

резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET)

Передача энергии от коротковолнового флуорофора к длинноволновому флуорофору, который гасит коротковолновое излучение.

флуорофор

Флуоресцентная группа, излучающая свет с большей длиной волны после воздействия света с другой длиной волны.

шпилька

ПЦР с горячим стартом

Структура ДНК, которая образуется, когда две области комплементарной последовательности рядом друг с другом отжигаются.

индексная последовательность

Уникальная нуклеотидная последовательность, добавленная в кассету для маркировки гена меткой для последующего анализа.

5′-зонд нуклеазы

интеркалирующий флуоресцентный краситель

Флуоресцентная молекула, которая излучает флуоресцентный свет только тогда, когда она встроена или интеркалирована между парами оснований двухцепочечной ДНК.

обратная ПЦР

Метод использования ПЦР для амплификации неизвестных последовательностей путем циркуляризации молекулы-матрицы.

ПЦР с длинным диапазоном

Реакция ПЦР, используемая специально для амплификации более длинных последовательностей-мишеней, чем стандартная ПЦР.

температура плавления (T _m)

(праймера ПЦР) Температура, при которой половина праймеров связывается водородными связями с их комплементарной последовательностью в целевой ДНК, а другая половина не присоединяется.

ошибочное зачисление

(в ПЦР) Когда праймеры ПЦР связываются в неправильном месте и позволяют ДНК-полимеразе создавать копии неправильной ДНК в образце.Это может быть вызвано слишком низкой температурой отжига или плохо спроектированными праймерами ПЦР, которые комплементарны повторяющейся ДНК в геноме.

молекулярный маяк

Флуоресцентный зонд, который содержит как флуорофор, так и группу тушения, соединенную структурой ДНК шпильки. Зонд флуоресцирует только тогда, когда он связывается с определенной последовательностью-мишенью ДНК, которая высвобождает шпильку и отделяет флуорофор от гасителя.

молекулярное сшивание

Создание гибридного гена путем соединения сегментов из нескольких источников с помощью ПЦР.

мультиплексная кПЦР

Использование нескольких наборов праймеров и различных флуоресцентно меченных зондов 5′-нуклеаз для одновременного количественного определения накопления нескольких целевых последовательностей.

oligo (dT) primer

Праймер, представляющий собой цепь из 18–20 T, которая предназначена для отжига с любой мРНК с полиА-хвостом. Используется в ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) для преобразования всех мРНК полиА в образце в кДНК.

праймер перекрытия

ПЦР-праймер, который соответствует небольшим областям двух разных генных сегментов и используется для соединения сегментов ДНК из разных источников.

ПЦР-ампликон

Конечные копии целевой ДНК, созданные во время реакции ПЦР.

Аппарат ПЦР

См. Термоциклер.

Праймеры для ПЦР

Короткие фрагменты одноцепочечной ДНК, комплементарные последовательностям на концах целевого сегмента ДНК. 3′-гидроксильная группа необходима ДНК-полимеразе для инициации синтеза ДНК.

Продукт ПЦР

Конечные копии целевой ДНК, созданные в ходе реакции ПЦР.

полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Амплификация последовательности ДНК путем повторяющихся циклов разделения цепей и репликации ДНК.

праймер-димер

Структура образуется, когда два праймера ПЦР отжигаются друг с другом, а не с целевой ДНК. Из-за комплементарных последовательностей между двумя праймерами ПЦР.

количественная ПЦР (кПЦР)

ПЦР, в которой добавление флуоресцентного красителя, такого как SYBR I Green, или добавление флуоресцентно меченого зонда 5’-нуклеазы позволяет измерить накопление продуктов ПЦР.Скорость накопления продуктов ПЦР показывает, сколько целевых ДНК присутствовало в образце, поскольку чем больше количество исходной целевой ДНК, тем быстрее накапливаются продукты ПЦР.

quencher

Молекула, которая предотвращает флуоресценцию, поглощая свет, излучаемый флуорофором.

случайный гексамер

Праймер длиной шесть нуклеотидов, синтезированный так, что каждый нуклеотид может быть любым из четырех оснований (G, A, T или C).Это смесь праймеров, каждая из которых имеет потенциальную последовательность из шести нуклеотидов, и, следовательно, существуют праймеры, комплементарные любой случайной последовательности из шести оснований в образце РНК.

ПЦР в реальном времени

ПЦР, в которой добавление флуоресцентного красителя, такого как SYBR Green I, или добавление флуоресцентно меченного зонда 5’-нуклеазы позволяет измерить накопление продуктов ПЦР. Скорость накопления продуктов ПЦР показывает, сколько целевых ДНК присутствовало в образце, поскольку чем больше количество исходной целевой ДНК, тем быстрее накапливаются продукты ПЦР.

контрольный образец

(в криминалистике) Образец ДНК, взятый у жертвы, любого подозреваемого и всех людей, имевших доступ к месту преступления. Продукты ПЦР из каждой контрольной пробы сравниваются с пробами, собранными на месте преступления, чтобы идентифицировать лиц, которые присутствовали на месте преступления.

обратная транскриптаза

Фермент, который начинается с РНК и создает ДНК-копию генетической информации.

ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР)

Вариант ПЦР, который начинается с мРНК для создания копий. Сначала мРНК преобразуется в кДНК с использованием обратной транскриптазы, а затем ПЦР делает несколько копий этой кДНК.

SYBR Green I

ДНК-связывающий флуоресцентный краситель, который связывается только с двухцепочечной ДНК и становится флуоресцентным только при связывании. В растворе краситель не флуоресцирует.

хвостовых праймеров ПЦР

праймеров ПЦР, которые имеют дополнительные последовательности на 5′-конце, которые включаются в конечный продукт ПЦР.

Полимераза Taq

Термостойкая ДНК-полимераза из Thermus aquaticus , которая используется для ПЦР.

целевая последовательность

Определенная область или последовательность в исходном образце ДНК, который амплифицируется в реакции ПЦР.

термоциклер

Устройство, используемое для быстрого и точного переключения между несколькими температурами в заданном порядке (для ПЦР).

Thermus aquaticus

Термофильные бактерии, обнаруженные в горячих источниках и используемые в качестве источника термостабильной ДНК-полимеразы для ПЦР.

ДНК-полимераза

Фермент, который образует полимер или цепочку ДНК путем соединения отдельных нуклеотидов.

5′-нуклеазный зонд

Короткий одноцепочечный фрагмент ДНК, комплементарный целевой ДНК и имеющий флуорофор, прикрепленный к 5′-концу, и гаситель, прикрепленный к 3′-концу.

Полимеразная цепная реакция — обзор

Что означает ПЦР? Кто это придумал?

Каков основной принцип ПЦР?

Назовите различные компоненты, необходимые для ПЦР.

Какой фермент используется в ПЦР? Объясните, почему этот фермент используется для реакции.

Какие этапы включают один цикл реакции ПЦР?

Что такое T _m? Почему это значение важно для ПЦР?

Опишите, какие типы параметров используются для расчета T _m грунтовки.

Что такое ошибочная заправка? Что может вызвать ошибочный старт в ПЦР?

Что такое вырожденные праймеры? Назовите два варианта использования вырожденных праймеров.

10.

Какие изменения в стандартной ПЦР сделаны для ПЦР на больших расстояниях?

11.

12.

Что такое обратная транскриптаза?

13.

Что такое кДНК? Как они сделаны?

14.

Каковы различные варианты использования ОТ-ПЦР?

15.

16.

Опишите, как SYBR Green I будет использоваться в кПЦР для оценки количества продукта ПЦР.

17.

Опишите, как 5 ’нуклеазный зонд используется в кПЦР для оценки количества продукта ПЦР.

18.

Объясните, как использование 5’-нуклеазного зонда может обеспечить большую специфичность во время кПЦР.

19.

Почему трудно получить полноразмерную кДНК с использованием обратной транскриптазы?

20.

Каковы два способа изменения оснований ДНК с помощью ПЦР?

21.

Какие этапы включают вставку или удаление ДНК с помощью ПЦР?

22.

Что такое мультиплексный КПЦР? Как проходит эта процедура?

23.

Назовите два применения ПЦР в медицинской диагностике.

24.

Каковы преимущества ПЦР-анализа в окружающей среде?

5′-зонд нуклеазы

отжиг

последовательность штрих-кода

Уникальная последовательность, добавленная в кассету для маркировки гена меткой для последующего анализа.

биомаркер

Измеримое вещество, обнаруженное в крови и т. Д., Которое указывает тип и / или тяжесть заболевания.

циркулирующая опухолевая ДНК (ктДНК)

комплементарная ДНК (кДНК)

вырожденный праймер

денатурация

направленный мутагенез

Преднамеренное изменение последовательности ДНК гена с помощью любого из множества искусственных методов.

удлинение

ДНК из окружающей среды (eDNA)

extension

резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET)

флуорофор

Флуоресцентная группа, излучающая свет с большей длиной волны после воздействия света с другой длиной волны.

шпилька

ПЦР с горячим стартом

индексная последовательность

5′-зонд нуклеазы

интеркалирующий флуоресцентный краситель

обратная ПЦР

ПЦР с длинным диапазоном

температура плавления (T _m)

ошибочное зачисление

молекулярный маяк

молекулярное сшивание

Создание гибридного гена путем соединения сегментов из нескольких источников с помощью ПЦР.

мультиплексная кПЦР

oligo (dT) primer

праймер перекрытия

ПЦР-ампликон

Конечные копии целевой ДНК, созданные во время реакции ПЦР.

Аппарат ПЦР

См. Термоциклер.

Праймеры для ПЦР

Продукт ПЦР

Конечные копии целевой ДНК, созданные в ходе реакции ПЦР.

полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Амплификация последовательности ДНК путем повторяющихся циклов разделения цепей и репликации ДНК.

праймер-димер

количественная ПЦР (кПЦР)

quencher

Молекула, которая предотвращает флуоресценцию, поглощая свет, излучаемый флуорофором.

случайный гексамер

ПЦР в реальном времени

контрольный образец

обратная транскриптаза

Фермент, который начинается с РНК и создает ДНК-копию генетической информации.

ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР)

SYBR Green I

хвостовых праймеров ПЦР

Полимераза Taq

Термостойкая ДНК-полимераза из Thermus aquaticus , которая используется для ПЦР.

целевая последовательность

Определенная область или последовательность в исходном образце ДНК, который амплифицируется в реакции ПЦР.

термоциклер

Thermus aquaticus

ДНК-полимераза

Фермент, который образует полимер или цепочку ДНК путем соединения отдельных нуклеотидов.

5′-нуклеазный зонд

ПЦР: полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция или ПЦР — широко используемый метод амплификации фрагментов ДНК.ПЦР использует термоциклирование, то есть повторное нагревание и охлаждение реакции с помощью трех различных температур, называемых денатурацией, отжигом и удлинением или удлинением.

Реакция термоциклирования начинается после того, как реагенты ПЦР помещаются в термоциклер — машину, которая запрограммирована на точный нагрев и охлаждение реакции.

Цикл ПЦР начинается с денатурации, которая происходит в течение 20–30 секунд при 95 ° C, что значительно выше температуры плавления ДНК. Температура плавления — это состояние, при котором половина ДНК представляет собой двухцепочечную спираль, а другая — одноцепочечную случайную спираль.Температура денатурации намного выше температуры плавления, чтобы гарантировать, что все водородные связи между комплементарными парами оснований разорваны, давая только одноцепочечные ДНК. Парные одиночные нити называются смысловыми и антисмысловыми цепями. Последовательность смысловой или кодирующей цепи идентична последовательности мРНК, которая в конечном итоге будет кодировать белок. Следовательно, в этом есть смысл. При чтении слева направо он начинается с 5 ’фосфата и заканчивается 3’ гидроксилом.Антисмысловая цепь также называется комплементарной цепью и начинается с 3 ’гидроксила и заканчивается 5’ фосфатом при чтении слева направо.

На втором этапе отжига короткие фрагменты ДНК, называемые праймерами, которые специфичны для смысловых или антисмысловых цепей, связываются посредством водородных связей. Праймер, который связывается с антисмысловой цепью и имеет ту же последовательность, что и смысловая цепь, является прямым или смысловым праймером. Праймер, который связывается со смысловой цепью и имеет последовательность, обратную и комплементарную смысловой цепи, является вашим обратным или антисмысловым праймером.В зависимости от длины используемых грунтовок температура отжига на этом этапе обычно на 3–5 ° C ниже более низкой температуры плавления двух ваших грунтовок. Отжиг обычно происходит при температуре от 50 до 65 ° C и длится от 20 до 40 секунд.

Как только праймеры связываются с ДНК, они инициируют реакцию, создавая конец 3’-гидроксильной группы, с которым будет связываться полимераза, фермент, который реплицирует ДНК.

Следующий этап, называемый удлинением или удлинением, происходит при 72 ° C, что является оптимальным для активности полимеразы.После связывания полимераза начинает добавлять свободные нуклеотидтрифосфаты, или dNTP, к концам праймера по одному в направлении от 5 ’к 3’ с образованием двухцепочечной ДНК.

После завершения удлинения начинается следующий цикл. В следующем цикле праймеры будут связываться с одноцепочечной ДНК, образованной в результате предыдущего удлинения. Короткий фрагмент, который вы пытаетесь амплифицировать, ампликон, в конечном итоге сформируется, когда полимераза выходит из прямого праймера на цепи, которая была получена путем амплификации с обратного праймера, или наоборот.После создания количество ампликона будет экспоненциально увеличиваться в последующих циклах. В зависимости от цели вашей реакции потребуется от 20 до 40 циклов.

Для длинных ампликонов финальную стадию элонгации обычно проводят при 72 ° C в течение 5–15 минут, чтобы гарантировать, что вся ДНК является двухцепочечной. Обычно последний этап выдержки при 4 ° C программируется в термоциклере в качестве меры предосторожности, чтобы гарантировать, что ДНК останется стабильной до тех пор, пока не будет извлечена из термоциклера.

Для реакции ПЦР требуется несколько основных реагентов.Во-первых, это шаблон ДНК, который представляет собой образец ДНК, из которого будет амплифицирован ваш фрагмент. Затем есть праймеры, которые представляют собой короткие фрагменты ДНК или олигонуклеотидов, запускающие полимеразную реакцию.

При выборе грунтовки необходимо учитывать несколько важных моментов. Во-первых, они должны быть комплементарны 5 ’и 3’ областям вашей ДНК-матрицы, фланкирующим последовательность, которую вы хотите амплифицировать. Во-вторых, они должны иметь длину от 15 до 30 пар оснований и примерно на 50% состоять из гуанинов и цитозинов.В-третьих, температуры плавления обоих праймеров должны быть выше 50 ° C и в пределах 1-2 градусов друг от друга, чтобы они могли эффективно связываться при одинаковой температуре отжига. В-четвертых, они не могут дополнять друг друга и образовывать димеры праймеров. И в-пятых, они не должны содержать вторичной структуры, образующейся в результате самоотжига внутри одного из праймеров.

Помимо праймеров и ДНК-матрицы, ДНК-полимераза необходима для реакции ПЦР. Наиболее часто в ПЦР используется фермент Taq-полимераза, термостабильный фермент, выделенный из бактерии Thermus aquaticus, обитающей в горячих источниках.Полимераза Taq может выдерживать температуры выше 90 ° C.

dNTP, которые будут составлять пары оснований в растущих цепях, также должны быть добавлены в реакцию. Буфер реакции, который поддерживает pH и содержит важные ионы, такие как марганец, магний и калий, также является необходимым компонентом реакции, который стабилизирует реакцию и обеспечивает важные кофакторы для фермента полимеразы. Как и во всех реакциях, для ПЦР требуется растворитель, поэтому используется вода, пригодная для ПЦР, не содержащая ионов, которые могут ингибировать реакцию.

Перед началом ПЦР убедитесь, что рабочая среда чистая, чтобы избежать загрязнения. Всегда нужно носить перчатки.

Для помощи в отслеживании различных компонентов реакции, которые вам понадобятся. Составьте таблицу объемов и концентраций реагентов для каждого образца, включая контроли. С точки зрения объемов типичная реакция должна содержать 5 мкл 10-кратного реакционного буфера, 4 мкл 25 мМ MgCl2, 1 мкл dNTP при 10 мМ, 2 мкл прямого и обратного праймеров при 50 нг / мкл и 0.3 мкл полимеразы Taq при 5 Ед / мкл. Вы хотите добавить достаточно шаблона, чтобы в реакции присутствовало 100 нг. Наконец, большинство реакций ПЦР проводят в общем объеме 50 мкл. Таким образом, необходимо использовать воду для ПЦР, чтобы гарантировать, что общий объем действительно составляет 50 мкл.

Как только ваша реакция будет спланирована на бумаге, соберите реагенты на льду.

Затем добавьте реагенты в пробирку для ПЦР. Сначала добавьте воду, затем шаблон, праймеры, буфер, хлорид магния и дНТФ, в последнюю очередь добавьте полимеразу Taq и тщательно перемешайте.

После настройки реакции поместите образец в термоциклер и запустите программу ПЦР. Вкратце, части машины состоят из термоблока, куда вставляется пробирка или планшет для ПЦР и который подвержен точным изменениям температуры. Крышка с подогревом, предотвращающая конденсацию и предотвращающая потерю пробы, и интерфейс с дисплеем для программирования температуры ПЦР и продолжительности цикла. Всегда настраивайте вашу программу перед сборкой реакции.

После того, как термоциклер сделает свою работу.Снимите реакцию и проверьте результат ПЦР с помощью гель-электрофореза. Если ПЦР прошла успешно, вы должны увидеть ампликон с правильным размером пары оснований.

А теперь несколько полезных советов при работе с ПЦР. Когда вы пытаетесь амплифицировать один и тот же продукт ПЦР из нескольких разных шаблонов и, следовательно, имеете много разных реакций на настройку. Для создания мастер-микса полезно масштабировать реакцию. Мастер-микс ПЦР представляет собой смесь большого объема всех реагентов, используемых в ваших образцах, которая позже распределяется по нескольким реакционным пробиркам.

Большинство реакций ПЦР начинаются с начальной стадии денатурации, которая происходит при 95 ° C в течение 1–9 минут. Этот шаг гарантирует, что весь шаблон является одноцепочечным для первого цикла амплификации.

Часто бывает желательно использовать шкаф ПЦР, когда риск заражения вашего образца высок. Чтобы проверить наличие каких-либо загрязнений в вашей реакции, полезно установить отрицательный контроль, который не имеет матрицы ДНК и не должен производить продукт в вашем геле ДНК.

Часто необходимо оптимизировать ПЦР, регулируя температуру, концентрацию хлорида магния или пробуя новые праймеры.Как только ваш ПЦР заработает. Хорошая идея — всегда использовать шаблон положительного контроля, который, как вы знаете, позволит создать продукт.

Существует множество вариантов и приложений ПЦР для различных целей.

Один из вариантов ПЦР, ПЦР с горячим стартом, включает в себя удержание полимеразы от реакции до окончания первой стадии денатурации, что предотвращает неспецифическую амплификацию, которая может произойти до цикла.

ПЦР также можно модифицировать для одновременной амплификации нескольких последовательностей ДНК путем использования нескольких праймеров в одной реакции ПЦР, называемой мультиплексной ПЦР.

В сочетании с флуоресцентными олигонуклеотидными зондами ПЦР может фактически стать методом, который может измерять относительные или абсолютные уровни экспрессии генов или количество мРНК, продуцируемых для данного гена или группы генов. Этот метод называется qPCR.

ПЦР также можно использовать для определения присутствия определенной последовательности ДНК в организме. Эта процедура называется генотипированием. Например, генотипирование можно использовать для определения подлинности образцов рыбы, выясняя, присутствует ли в образце видоспецифическая последовательность.Генотипирование также используется в судебно-медицинской экспертизе, чтобы определить, соответствует ли ДНК, обнаруженная на месте преступления, подозреваемому.

Вы только что смотрели введение JoVE в ПЦР. В этом видео мы рассмотрели, что такое ПЦР и как она работает, многие компоненты реакции ПЦР, механизм, с помощью которого ПЦР может амплифицировать ДНК, а также множество вариантов и применений этого очень полезного метода. Спасибо за просмотр!

полимеразная цепная реакция | Определение и шаги

Узнайте, как термоциклер ДНК использует полимеразную цепную реакцию для копирования цепей ДНК

Конкретные сегменты ДНК амплифицируются (копируются) в лаборатории с использованием методов полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Encyclopædia Britannica, Inc. См. Все видео к этой статье

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) , метод, используемый для быстрого и точного создания множества копий определенного сегмента ДНК. Полимеразная цепная реакция позволяет исследователям получать большие количества ДНК, необходимые для различных экспериментов и процедур в молекулярной биологии, судебно-медицинской экспертизе, эволюционной биологии и медицинской диагностике.

Британская викторина

Тест по генетике

Кто пришел к выводу, что пол человека определяется определенной хромосомой? Сколько пар хромосом находится в организме человека? Проверьте свои знания.Пройдите эту викторину.

ПЦР был разработан в 1983 году Кэри Б. Маллис, американским биохимиком, получившим Нобелевскую премию по химии в 1993 году за свое изобретение. До разработки ПЦР методы, используемые для амплификации или создания копий рекомбинантных фрагментов ДНК, были трудоемкими и трудоемкими. Напротив, машина, предназначенная для проведения реакций ПЦР, может завершить множество циклов репликации, производя миллиарды копий фрагмента ДНК всего за несколько часов.

Метод ПЦР основан на естественных процессах, которые клетка использует для репликации новой цепи ДНК. Для ПЦР требуется всего несколько биологических ингредиентов. Неотъемлемым компонентом является матричная ДНК, т. Е. ДНК, которая содержит участок, который нужно скопировать, например ген. Всего одна молекула ДНК может служить шаблоном. Единственная информация, необходимая для репликации этого фрагмента, — это последовательность двух коротких участков нуклеотидов (субъединиц ДНК) на обоих концах интересующей области.Эти две короткие матричные последовательности должны быть известны, чтобы можно было синтезировать два праймера — короткие участки нуклеотидов, соответствующие матричным последовательностям. Праймеры связываются или отжигаются с матрицей на своих дополнительных сайтах и служат отправной точкой для копирования. Синтез ДНК на одном праймере направлен навстречу другому, что приводит к репликации желаемой промежуточной последовательности. Также необходимы свободные нуклеотиды, используемые для построения новых цепей ДНК, и ДНК-полимераза, фермент, который выполняет построение путем последовательного добавления свободных нуклеотидов в соответствии с инструкциями шаблона.

ПЦР — это трехэтапный процесс, который выполняется в повторяющихся циклах. Первым шагом является денатурация или разделение двух цепей молекулы ДНК. Это достигается путем нагревания исходного материала до температуры около 95 ° C (203 ° F). Каждая прядь — это шаблон, по которому строится новая прядь. На втором этапе температура снижается примерно до 55 ° C (131 ° F), чтобы праймеры могли отжигаться с матрицей. На третьем этапе температура повышается примерно до 72 ° C (162 ° F), и ДНК-полимераза начинает добавлять нуклеотиды на концы отожженных праймеров.В конце цикла, который длится около пяти минут, температура повышается, и процесс начинается снова. Количество копий удваивается после каждого цикла. Обычно от 25 до 30 циклов вырабатывается достаточное количество ДНК.

Получите подписку Britannica Premium и получите доступ к эксклюзивному контенту. Подпишитесь сейчас

В исходной процедуре ПЦР одна проблема заключалась в том, что ДНК-полимеразу приходилось пополнять после каждого цикла, потому что она нестабильна при высоких температурах, необходимых для денатурации.

ru:about:media:2019:20202401 [Институт химической биологии и фундаментальной медицины]

Что такое ПЦР-анализ?

сферы применения, подготовка к исследованию, анализы на инфекции

Принцип ПЦР- исследования

Кому мы обязаны появлением метода ПЦР?

Как это все происходит в лаборатории

Выделение ДНК

Элонгация

Детекция

Преимущества методики ПЦР

Области применения в медицине

Сделать молекулярно-биологические (пцр) исследования в Тюмени, цены

Суть метода

Подготовка пациента

Перечень анализов

ПЦР — диагностика инфекционных заболеваний

Гепатит B и C

ПЦР диагностика на скрытые инфекции

Метод ПЦР диагностики — что показывает ПЦР тест, точность исследования

Что такое полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Справочная информация

Протокол видео

Базовая программа ПЦР

Перечень материалов

Процедура

Дизайн праймеров и ПЦР

Приготовление мастер-микса

Праймеры для разбавления

Советы и часто задаваемые вопросы

Что такое ПЦР? — Руководство для начинающих

Основные ингредиенты для ПЦР:

Полимераза

Шаблон ДНК

Грунтовки

Нуклеотиды

Буфер

Термоциклирование:

1. Инициализация

2. Денатурация (повторение 15-40 раз)

3. Отжиг (15-40 раз)

4. Удлинение или удлинение (повторяется 15-40 раз)

5. Окончательное удлинение

6. Финальная задержка

Что такое ПЦР? — Science Learning Hub

Как работает ПЦР?

Что такое процесс ПЦР?

Природа науки

Полимеразная цепная реакция — обзор

Полимеразная цепная реакция — обзор

ПЦР: полимеразная цепная реакция

полимеразная цепная реакция | Определение и шаги

Написать ответ Отменить ответ