Пцр диагностика что: что это такое? Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции

• Высочайшая специфичность – В процессе анализа в исследуемом материале выделяется фрагмент ДНК, специфичный (присущий) только конкретному возбудителю —  бактерии или вирусу. Этот участок ДНК уникален и не характерен ни для одной другой инфекции на Земле. Можно говорить, что специфичность метода достигает 100% или близка к этому. Это позволяет в одном и том же материале, проводить одновременный поиск нескольких возбудителей без какого-либо ущерба качеству.
• Высочайшая чувствительность –  Метод ПЦР позволяет выявить одну-единственную болезнетворную бактерию среди миллиардов других, предоставив через несколько часов, 50 миллиардов ее копий! Он работает там, где другие методы: микроскопический, бактериологический, иммуноферментный, бессильны. Достоверный диагноз при помощи ПЦР можно ставить по 10 — 100 возбудителям в пробе, в то время как для других тестов эта цифра составляет 1000 — 1000 000.
• Оперативность —  Постановка реакции занимает всего несколько часов, т.к. не требуется искусственное выращивание возбудителя. Процесс максимально автоматизирован. Таким образом, вся диагностика, от момента сдачи материала на анализ до получения результата, отнимет один день.
• Прямое определение возбудителей инфекционных заболеваний – методом  ПЦР определяют возбудителя, а не реакцию на его внедрение со стороны организма. Таким образом, появилась возможность точно диагностировать заболевание еще в инкубационном периоде, когда нет никаких клинических или лабораторных признаков болезни.
• Абсолютная универсальность — ПЦР позволяет обнаруживать любые ДНК и РНК, даже когда бессильны другие методы. Оборудование, используемое для ПЦР, стандартно, оно не зависит от того, что именно и где именно мы ищем. Для ПЦР-исследования может применяться практически любые материалы, в том числе недоступные для исследования другими методами: слизь, моча, кровь, сыворотка, мокрота, эякулят, соскоб эпителиальных клеток, почва и т.д.

Думается, пришло время, перейти от восторженных эпитетов и хвалебных речей к описанию, собственно ПЦР метода. И постараться сделать это так, чтобы даже максимально далёкий от молекулярной биологии читатель, смог оценить красоту и изящество метода, а заодно уяснить за что же, собственно, дают Нобелевскую премию…. 

Для начала, нужно понять сущность решаемой задачи и основную проблему, мешающую нам всё устроить легко и просто….

Уже задолго до начала 80-х годов учёным биологам было ясно, что анализ генетической информации содержащеёся в хромосомах любой живой (да и не вполне живой, тоже) клетки, позволяет однозначно определить хозяина этих клеток. Это относится, как к человеку и животным, так и к мельчайшим бактериям и вирусам – без исключений. Вся генетическая  информация записана внутри ДНК.   Так вот, решаемая в ту пору  задача формулировалась весьма просто — хорошо бы найти метод, который позволил бы извлекать из клетки  ДНК, и идентифицировать ее по принципу: «Это ДНК вируса гриппа, это — стафилококка, а это — хламидии». Тогда, взяв у человека каплю крови, мокроту, мочу и т.д., можно было бы легко установить, не содержатся ли в этих биологических пробах возбудители инфекций.  Но… Во-первых, выделить ДНК из клеток неповрежденной практически невозможно — она рвется в произвольных местах, и даже  выделяя её 100 раз из 100 одинаковых клеток, мы получим  тысячи кусков генов во фрагментах разной длины. Ясно, что ни сравнивать, ни анализировать тут будет нечего. Во-вторых, даже если каким-то чудом удастся выделить и безошибочно определять ДНК возбудителя инфекции, сложности остаются. Ведь ДНК, например, вируса, содержится в пробе, среди миллиардов других клеток,  в таких ничтожных количествах, что её запросто можно не заметить, и получить отрицательный результат вместо положительного. Можно, конечно, искусственно вырастить культуру для увеличения объема вирусной ДНК, но, во-первых, не все возбудители болезней хорошо культивируются в искусственных условиях, и, во-вторых, на это требуется значительное время…

Теперь нам пора разобраться с мироустройством, и начать называть вещи своими именами.  Итак, что же это такое ДНК и РНК,  как это всё устроено и из чего состоит ?

Каждая клетка любого живого существа (животного, растения, человека, бактерии, вируса) имеет хромосомы. Хромосомы – это хранители генетической информации, которые содержат всю последовательность генов каждого конкретного живого существа, его геном.  Каждая хромосома состоит из двух нитей ДНК, закрученных в спираль друг относительно друга. Это весьма напоминает винтовую лестницу, «перила» которой удерживаются вместе за счёт «ступенек».  

ДНК (ДезоксирибоНуклеиновая Кислота) имея чрезвычайно сложную структуру, тем не менее,  строится из достаточно простых структурных компонентов, тех самых «ступенек»  – нуклеотидов.

Нуклеотиды бывают 5-и видов :

• Тимин (Thymine)      ( T )
• Аденин (Adenine)    ( A )
• Гуанин (Guaninne)   ( G )
• Цитозин (Citosine)   ( C )
• Урацил (Uracil)         ( U )

Нуклеотиды располагаются друг за другом в строгой индивидуальной последовательности, образуя гены. Один ген может состоять из 20-200 таких нуклеотидов. Например, наш  ген, определяющий выработку инсулина, состоит из 60 пар нуклеотидов.

«Ступеньки» в нашей «лестнице», на самом деле не целые, а состоят из 2-х половинок – 2-х разных нуклеотидов.  Но всё дело в том, что половинки не могут соединяться, как попало, а только особыми «комплементарными» парами. Комплементарность – это точное взаимное соответствие и взаимное дополнение. Если хотите — единство противоположностей!  Нуклеотиды обладают свойством комплементарности,  т.е. сцепляться друг с другом могут только нуклеотиды, входящие в одну комплементарную пару. Никакие другие связи в природе не возможны. Это весьма напоминает поведение магнитов, когда южный полюс легко сцепляется с северным, а попытки соединить юг с югом и север с севером обречены на провал… Здесь тоже самое, только полюсов не два, а четыре (попробуйте это себе представить). Свойство комплементарности — ключевое в методе ПЦР.

Комплементарными являются пары Тимин — Аденин  и Гуанин – Цитозин.

Практически это означает, что напротив аденина (A) в одной цепочке ДНК, в другой цепочке обязательно стоит тимин (T), а напротив гуанина (G) – цитозин (C). Схематически  всё это выглядит следующим образом:

Кроме ДНК, точно такую же структуру имеет РНК ( рибонуклеиновая кислота ), отличающаяся от ДНК тем, что вместо тимина в ней используется урацил и комплементарная пара имеет вид A — U.

РНК – является хранителем генетической информации у некоторых вирусов, которые называются ретровирусами. Наиболее известный и активно изучаемый представитель этого поганого семейства  —  ВИЧ.

Чтобы представить сложность структуры ДНК и РНК, вдумайтесь в следующий факт: если развернуть спираль ДНК, её длина окажется около ста восьмидесяти сантиметров. Не смотря на то, что размеры клетки исчисляются микронами, из-за очень специфической плотной упаковки спирали, ядро клетки свободно вмещает десятки хромосом.

Итак, пора переходить к решению задачи. 

Рассматривая поставленную выше задачу, мы уже увидели две основных проблемы на пути к её решению. Понятно, что с одной стороны, выискивать клетку возбудителя инфекции среди миллионов клеток крови – занятие достаточно бесперспективное, если не сказать бестолковое, а с другой стороны,  выделять ДНК из клеток » в рукопашную» – тоже не вариант, из-за опасности  порвать на кусочки, всё что мы с таким трудом отыскали… Поэтому, нам очень помог бы какой-нибудь метод, позволяющий активно размножать ДНК, но делающий это только с определёнными, «избранными» экземплярами. Это позволит увеличивать концентрацию интересующей культуры до уровней, безошибочно определяемых и не требующих длительного поиска. 

Вот этим чудо-методом и стал метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).  В основе метода ПЦР лежит природный процесс — комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы. Эта реакция носит название репликации ДНК.  Так это звучит сухим академическим языком. Но мы задались целью, объяснить Вам всё, буквально, «на пальцах», а потому продолжим свой рассказ о том, как всё происходит.

На первом этапе реакции надо разъединить двойную нить ДНК. Этот процесс называется денатурацией и проходит при температуре 93 — 95 градусов Цельсия. Уже через 30 — 40 секунд связи нуклеотидов разрываются и вместо двойной цепи получаются две одиночные.

Надо заметить, что если после этого, снова, просто понизить температуру, то разделившиеся половинки достаточно быстро находят друг друга и всё возвращается, практически, к исходному состоянию. Следовательно, нам надо не дать соединиться половинкам интересующей нас ДНК. Как этому помешать? – приставить на её место (хотя бы временно) что-то, что точно соответствует небольшому фрагменту ДНК и в точности повторяет комплементарную последовательность небольшой цепочки нуклеотидов. Тогда, место на половинке-основании окажется занято, при попытке присоединения, свойство комплементарности окажется нарушено, и вторая половинка не сможет прицепиться на своё «законное» место. Это «что-то» названное праймером,  синтезируется в научной или промышленной лаборатории и представляет собой цепочку синтетических нуклеотидов (олигонуклеотидов), расположенных в таком же порядке, как и у того вируса (бактерии и так далее), на который делается анализ. Например, если делают анализ на хламидии, то праймер соответствует специфическому участку гена, кодирующего главный белок наружной мембраны (МОМР) Chlamydia trachomatis.

Итак, вторая стадия — присоединение праймеров к ДНК (также называется отжигом)  длится от 20 до 60 секунд. Температура отжига равна 50 — 65 градусам (для каждого вида возбудителей, т.е. для каждого праймера, она своя).

На этом этапе мы уже разделили ДНК на две половинки и не даём им соединиться. Теперь самое время достроить каждую половинку до полноценной ДНК. Но температура, при которой это должно произойти, очень высока, по меркам молекулярной биологии  – более 70 градусов (выше температуры отжига). Проблема была решена благодаря открытию уникального фермента taq-ДНК-полимеразы, содержащегося у бактерий, обитающих в гейзерах. Особенность этого фермента заключается в его исключительной термостойкости (период полужизни при 95 градусах составляет 40 минут) и высокой рабочей температуре — оптимум работы 72градуса. В клетках, фермент ДНК-полимеразы отвечает за копирование и «ремонт» ДНК и способен удлинять короткие нуклеотидные цепочки праймеров, последовательно присоединяя к одному из концов праймера дополнительные нуклеотиды, таким образом, достраивая цепь до конца. Так ДНК копирует саму себя.

Третий этап — достраивание цепей ДНК. Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от конца к концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор «кирпичики» — все те же производные аденина, гуанина, цитозина и тимина. Процесс синтеза катализируется ферментом термостабильной ДНК-полимеразой (Taq-полимеразой) и проходит при температуре 70 — 72 градуса. Время протекания синтеза зависит от длины достраиваемого фрагмента и обычно принимается равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований.

Теперь мы имеем две двойные цепочки ДНК вместо одной, исходной.

Ну а дальше процесс повторяется. Опять температура повышается до 93 — 95 градусов, цепочки разъединяются… и так далее. Обычно за 1 — 2 часа при наличии вирусной ДНК ее становится столько, что не заметить ее, даже при стандартном методе обнаружения становится просто нереально.

Схематично, это выглядит так:

Подведём итог: каждый цикл ПЦР состоит из трех стадий. В первую стадию (денатурация) происходит так называемое раскручивание ДНК – то есть разделение связанных между собой двух цепей ДНК. Во вторую (отжиг) — происходит присоединение праймера к участку нити ДНК. И, наконец, в заключительной третьей стадии, «фермент-строитель»  достраивает нити, восстанавливая ДНК.   В настоящее время весь этот сложный процесс протекает в одной пробирке и состоит из повторяющихся циклов размножения (амплификаций) определяемой ДНК с целью получения большого количества копий, которые могут быть, затем выявлены обычными методами. То есть из одной нити ДНК мы получаем сотни тысяч или миллионы копий.

Полимеразная цепная реакция требует быстрой смены температур, ведь идет она в три этапа. Поначалу для каждой стадии использовали отдельную водяную баню, что сильно увеличивало время получения результата. Поставить «на поток» метод помогли специальные автоматические термостаты — амплификаторы, в которых изменение температуры происходит по заданной программе. Современный амплификатор – сложный электронный прибор, не только управляющий циклами амплификации и поддерживающий необходимые температуры, но и делающий количественные замеры после каждого цикла.

Эта технология называется «Real-Time PCR», или ПЦР в реальном времени. В её основе лежит принцип флуоресцентной детекции продуктов ПЦР непосредственно в ходе амплификации. Детекция продуктов амплификации проводится прямо в реакционной среде через стенки или крышку закрытой пробирки.

Для этого в состав реакционной смеси, наряду с праймерами  и другими компонентами реакции, добавлены специальные флуоресцентные метки (зонды). Флуоресцентный зонд выполнен по той же технологии, что и праймер и отличается он него тем, что на одном его конце прикреплена флуоресцентная молекула (флуорофор), а на другом конце расположена специальная молекула-гаситель флуоресценции. За счёт близости гасителя, энергия поглощаемая флуорофором не вызывает флуоресцентного свечения, а целиком передаётся гасителю. При этом, при облучении смеси ультрафиолетом, флуоресцентный отклик полностью отсутствует.

Дальше всё происходит, так же, как было описано выше:

• В ходе ПЦР при повышении температуры происходит денатурация ДНК с распадом на две половинки.
• Зонд вместе с праймерами присоединяется к комплементарному участку ДНК.
• В процессе восстановления и синтеза новой цепи ДНК, фермент ДНК-полимеразы расщепляет этот зонд и разрушает его. При этом флуорофор и гаситель освобождаются, расстояние между ними увеличивается и эффект гашения перестаёт работать. Теперь при облучении смеси ультрафиолетом, мы получим устойчивый флуоресцентный сигнал-отклик от флуорофора.

Изготавливая молекулы флуорофора с разным цветом свечения можно проводить  одновременный поиск разных возбудителей в одной пробирке.

Большинство используемых сегодня, для ПЦР диагностики, амплификаторов , относится к классу автоматических, высокоскоростных многофункциональных Real Time аппаратов. Они позволяют проводить множественный ПЦР анализ  до 5 мишеней (цветных флуоресцентных красителей) в 96 пробирках одновременно. Это полностью автоматические термоциклеры со встроенным оптическим блоком и возможностью детекции накопления продуктов амплификации непосредственно в пробирке во время протекания реакции. Весь процесс амплификации протекает в закрытых одноразовых пробирках, считывание происходит через прозрачные стенки пробирок, без их открытия. Например, на фото CFX96 Touch, производства американской компании  Bio-Rad

Безусловно, ПЦР не идеальный метод, и у него имеются свои недостатки. Но они напрямую связаны с его достоинствами и с тем, что называется «человеческим фактором».

• ПЦР – высокотехнологичный метод, требующий соблюдения строжайших правил устройства и оснащения  лаборатории. Достаточно сказать, что на рабочем месте, где происходит приготовление и раскапывание смесей по пробиркам, должен быть установлен фильтр биологической очистки со степенью более 99%.  Это связано с тем, что в воздухе постоянно присутствует невероятный коктейль из фрагментов ДНК всевозможных живых организмов. И если в процессе подготовки к проведению реакции, образец будет загрязнен — возможно «ложное срабатывание».
• С другой стороны, далеко не всегда положительный результат ПЦР означает наличие заболевания. Например, человек пролечился от какого-либо заболевания, но погибший и уже не опасный возбудитель (фактически его останки) будет еще некоторое время находиться среди клеток крови и «разбираться на запчасти» защитной системой организма. Если в этот момент сделать ПЦР – результат окажется положительным.
• Другой вариант – это отрицательный результат ПЦР при наличии даже явной клинической картины. Одна из наиболее возможных причин – материал для исследования был взят «не оттуда». Образец должен брать квалифицированный врач, строго следуя инструкции, которую ему дает лаборатория.
• При создании праймеров используют специфичный для данного микроорганизма фрагмент ДНК, наименее подверженный изменениям. Он выбирается из так называемой высоко консервативной области ДНК. Но изменчивость микроорганизмов может приводить к тому, что некоторые генотипы или штаммы исследуемого возбудителя могут приобретать и накапливать мутации в амплифицируемом (клонируемом) участке генома, и становиться неуловимыми для данного праймера, и тест-системы, в целом. Таким образом, различные тест-системы — одна из причин, почему анализы, сделанные в разных лабораториях и в разных клиниках «одним и тем же» методом ПЦР могут показывать разные результаты. Чтобы максимально избежать ошибок по вине мутаций, современные стандарты качества, регламентируют объем испытаний тест-системы, прежде чем она попадет на рынок и будет использована для диагностики. Эти испытания включают проверку на перекрестные реакции, а также тестирование всех известных штаммов определяемого возбудителя.

Полный список исследований методом ПЦР и цену на них  можно посмотреть в разделе «Прейскурант»
 

Что такое ПЦР-анализ? Ответы на вопросы о ПЦР-диагностике

К нам часто поступает множество вопросов, касающихся такого метода лабораторной диагностики как ПЦР. В своей статье, мы постарались рассмотреть самые актуальные из них.

Надеемся наш материал будет полезным для Вас!

Что такое ПЦР-диагностика?

ПЦР-анализ (полимеразная цепная реакция) — это высокоточный метод диагностики многочисленных инфекций, основанный на анализе генетического материала (ДНК и РНК). Для диагностики используется слюна, кровь, мокрота, выделения половых органов и прочее биологические материалы, в зависимости от целей исследования.

Какие опасные инфекции можно выявлять в реанимации методом ПЦР?

Методом ПЦР можно выявлять любые опасные инфекции, которые приводят к критическому состоянию пациента. Своевременное выявление инфекционного агента, вызвавшего данное состояние, позволит правильно скорректировать лечение и спасти жизнь.

Подойдёт ли этот метод для скрининга, для подтверждения диагноза?

Скрининговый анализ, в общем понимании, действительно не совсем подходящий метод для неотложной медицины. Скрининг, по большей части, является профилактическим мероприятием и представляет собой массовые тотальные исследования по выявлению скрытых, внешне не проявляющихся или недавно начавшихся патологических процессов у пациентов. Например, ПЦР-диагностика прекрасно используется в гинекологической практике для скрининга вируса папиломы человека (ВПЧ) или болезней, передающихся половым путём (ЗППП). Также ПЦР метод широко используется для скринингового тестирования плазмы крови на предмет выявления вирусов гепатита В, С, D, E. И так далее.

Для скрининга эффективнее использовать ныне устаревающий метод ИФА или современной ИХЛА?

С методами ИФА и ИХЛА не всё так однозначно. Они выявляют косвенные признаки патологических изменений и это является их главным недостатком. Организму на вредное воздействие необходимо вначале сформировать иммунный ответ, наработать антитела, которые в последующем возможно выявить только со временем. Может возникнуть ситуация, когда организм уже заражен какой-либо инфекцией, а антител к ней еще нет или их титр находится ниже порога чувствительности тест-набора. Или наоборот – возбудителя уже нет в организме, а антитела ещё выявляются.

Хронологически метод ПЦР в клинической практике появился позже ИФА и ИХЛА и по факту является более современным. По показателям специфичности и чувствительности ПЦР выше данных иммунологических методов. К тому же ПЦР-анализ выявляет прямую первопричину процессов – их генетическую основу, а не следствие. Для получения нужного результата при постановке ПЦР нет необходимости выявлять весь геном мишени. Задачи по анализу всего генома решаются с помощью других методов (например, таргетный или полногеномный анализ с помощью секвенирования нового поколения – NGS). С помощью ПЦР-теста выявляется высоко консервативный фрагмент ДНК (определённая нуклеотидная последовательность), однозначно характеризующий мишень. А при методе ПЦР в реальном времени можно даже определить изначальное количество мишени в пробе.

Что этот метод даст для лечения и выявления мультирезистентного штама микобактерий?

Выявление мультирезистентных шаммов позволит изначально не использовать те антибиотики, к которым у возбудителя существует генетически обусловленная стойкость, а использовать другие препараты. Например против штаммов Mycobacterium tuberculosis, устойчивых к Изониазиду и Рифампицину сразу применять фторхинолоны или инъекционные препараты.

Можно ли при ВИЧ вылечить чувствительные штаммы?

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) вообще не восприимчив ко антибиотикам и противомикробным препаратам, потому что не является бактерией. Против вирусов необходимо применять противовирусные препараты. Трудность лечения вирусных заболеваний вообще и СПИДа в частности обусловлена их биологической особенностью – активная фаза жизнедеятельности вируса проходит только внутри живой клетки. Поэтому вирусные частицы защищены от воздействий внешней среды. Уничтожить вирус можно только с клеткой, в случае с ВИЧ – с клеткой иммунной системы.

Как исследование соотношения субпопуляций лейкоцитов выявляет онкомаркеры?

Числовое значение соотношения субпопуляций лейкоцитов является индикаторным или маркерным показателем наличия онкологического процесса, т.е. одним из онкомаркеров. В норме и при патологии данное значение отличается. Например, при значениях CD4+/CD8+ в диапазоне от 1,2 до 2,6 может свидетельствовать о возможном наличии в организме множественной миеломы или солидных опухолей. Увеличение значения более до 3 и более может указывать на острый Т-лимфобластный лейкоз или хронический Т-лейкозе. И т.д. Другими словами –в данном случае преобладание Т-хелперов над Т-киллерами специфически информативно.
Но онкомаркеры могут быть и генетическими. На сегодняшний момент обнаружены тысячи мутантных аллелей генов, которые с той или иной вероятностью могут приводить к развитию онкологического процесса. На рынке существует множество тест-систем для выявления онкомаркеров разных производителей.

Рак шейки матки целесообразно предотвращать (или диагностировать на ранней – внутриэпителиальной стадии) до его развития путём разработки и внедрения государственных программ по тотальному скринингу женщин на наличие ВПЧ с регулярными подтверждающими цитологическими исследованиями. Также огромным фактором по своевременному предотвращению данного заболевания будет внедрение вакцинации против ВПЧ всех младенцев при рождении (и мальчиков и девочек).

тестирование — что это такое, как работает метод ПЦР, показания, подготовка к проведению ПЦР-теста, как проводится ПЦР-анализ, результаты теста

Опубликовано: 10.02.2021 13:07:00    Обновлено: 18.02.2021   Просмотров: 2833

ПЦР – высокоточный метод диагностики и одно из самых главных открытий в области биологии за последние десятилетия. ПЦР-анализ применяется уже почти 40 лет и считается наиболее точным и чувствительным способом диагностики инфекционных заболеваний.

ПЦР – уникальный и универсальный метод, тест используется не только в клинической лабораторной диагностике, но также в биологии, криминалистике, археологии и многих других научных областях. Все, что нужно для проведения анализа – небольшое количество любого биоматериала пациента.

Суть метода ПЦР

Генетическая информация любого живого организма записывается в ДНК. Эта молекула состоит из двух цепочек, сплетающихся в единую спираль. Некоторые вирусы (например, COVID-19) хранят свой код в РНК – одной нити нуклеотидов.

Для каждого организма, включая вирусы, бактерии и грибки, последовательность нуклеотидов уникальна. Ее можно сравнить с отпечатком пальца или сканом сетчатки глаза человека. Укороченные последовательности нуклеотидов, характерные для каждого вида патогена (возбудителя опасных заболеваний), хранятся в базах научных лабораторий в виде праймеров – отдельных участков ДНК, типичных для только конкретного возбудителя. Эти участки значительно короче любой молекулы ДНК. Такие праймеры присоединяются к ДНК возбудителя в пробе и под действием катализаторов многократно воспроизводят свои дубли. Этот процесс называются «репликация» – многократное увеличение, дублирование искомого участка до тех пор, пока он не станет доступен для определения. Процесс репликации возможен только при наличии в пробе ДНК возбудителя.

Преимущества метода ПЦР

1. Высокая специфичность. Метод ПЦР определяет заданную последовательность нуклеотидов, присущую конкретному патогену. Таким образом, специфичность теста стремится к 100%. Исключен риск ложноположительных результатов.
2. Чувствительность. Для ПЦР достаточно всего несколько молекул ДНК патогена (или даже уже неактивных – разрушенных вирусных частиц, сохранивших специфические участки ДНК в достаточном количестве), чтобы он был обнаружен в ходе исследования.
3. Скорость проведения. Лаборатория получает результат ПЦР-теста через несколько часов, клиент – уже на следующий день. Скорость диагностики имеет принципиально важное значение для своевременного лечения. Например, при диагностике бактериальных инфекций классический посев занимает от нескольких дней, а с ПЦР-анализом пациент сможет принять меры и начать лечение уже через сутки.
4. Универсальность. Для исследования подходит любой биоматериал: кровь, моча, сперма, мокрота, гной, жидкости из абсцессов и пр. Кроме этого, ПЦР применяется в самых разных областях науки и медицины, работая даже там, где другие методы бессильны.
5. Диагностика латентных инфекций. ПЦР-диагностика определяет возбудителя инфекции даже в инкубационном периоде и при скрытом течении заболевания.

Какие есть недостатки

Показания к проведению ПЦР-анализа

• Диагностика инфекционных заболеваний (гепатит, ВИЧ, TORCH-инфекции и огромное множество других видов патогенов).
• Урогинекология (диагностика инфекций, передающихся половым путем: хламидиоз, уреаплазма, микоплазма, кандиды, гарднерелла, герпесвирусы). Важное значение для женского и мужского здоровья играет ВПЧ – вирус папилломы человека. Доказано, что у женщин онкогенные штаммы этого вируса способны вызывать рак шейки матки.
• Неонатология. Существует целый ряд инфекций, способных поражать плод еще в материнской утробе. Среди них вирусы герпеса, токсоплазмы, краснухи. ПЦР-диагностика позволяет правильно определить тактику ведения и риски внутриутробной инфекции.
• Респираторные заболевания. Диагностика методом ПЦР стала в 2020 году актуальной как никогда и продемонстрировала свою незаменимость и эффективность. ПЦР-анализ – главный тест и «золотой стандарт» диагностики коронавирусной инфекции Sars-Cov-2 (COVID-19), ставшей причиной самой масштабной пандемии последних десятилетий.
• Генетика. Наследственные заболевания и отцовство также диагностируются при помощи метода ПЦР.

Подготовка к проведению ПЦР-теста

• Анализ сдается утром натощак. При этом ряд генетических исследований проводится в произвольное время, удобное пациенту.
• При сдаче анализа по мазку из ротоглотки необходимо выдержать интервал с приемом пищи и воды в 3-4 часа перед тестом.
• Перед анализом на венерические инфекции необходимо воздержаться от половой активности в течение суток.
• Перед анализом нельзя использовать никакие противовирусные препараты.

Как проводится ПЦР-анализ

1. С обратной транскрипцией. Самый распространенный способ идентификации известной последовательности РНК, включающий амплификацию, определение патогена и его идентификации среди образцов, хранящихся в научной картотеке.
2. Вложенная ПЦР (или «гнездовая») — используется для снижения количества неспецифичных продуктов реакции и имеет две стадии с использованием двух видов праймеров.
3. Изотермические методы – не требуют повторяющихся температурных циклов, менее энергозатратны.
4. Инвертированная ПЦР — применяется, если имеется только короткий фрагмент известной последовательности, но необходимо определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном.
5. ПЦР в реальном времени — метод, позволяющий определить не только присутствие целевой нуклеотидной последовательности в образце, но и измерять количество ее копий после каждого цикла амплификации, что дает возможность для проведения тестов с количественным результатом

Результаты ПЦР-теста

Результаты ПЦР-теста дадут точную информацию о том, какая инфекция была обнаружена. При количественном тестировании анализ определит также вирусную или бактериальную нагрузку на организм. В этом случае в результатах будет значиться титр обнаруженного патогена (его количество в одном миллилитре пробы). Количественный анализ особенно важен при диагностике заболеваний, спровоцированных условно-патогенными микроорганизмами, которые присутствуют в норме практически у каждого человека. Такие микроорганизмы представляют угрозу только при большой численности, а в остальных случаях мирно сосуществуют с носителем.

ПЦР метод сдачи анализа на инфекции, полимеразная цепная реакция

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрёл в 1983 году Кэри Мюллис (американский учёный). Впоследствии он получил за это изобретение Нобелевскую премию. В настоящее время ПЦР-диагностика является, одним из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний.

Основа метода ПЦР

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе). В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.

Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.

Эффективность диагностики инфекций 

ПЦР — метод молекулярной диагностики, ставший для ряда инфекций «золотым стандартом», проверен временем и тщательно апробирован клинически. Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя.

ПЦР позволяет диагностировать наличие долго растущих возбудителей, не прибегая к трудоёмким микробиологическим методам, что особенно актуально в гинекологии и урологии при диагностике урогенитальных инфекций, передающихся половым путем (ИППП).

Также, этим методом проводят диагностику вирусных инфекций, таких как гепатиты, ВИЧ и др. Чувствительность метода значительно превосходит таковую у иммунохомических и микробиологических методов, а принцип метода позволяет диагностировать наличие инфекций со значительной антигенной изменчивостью.

Специфичность ПЦР при использовании технологии PCR даже для всех вирусных, хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 100%. Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно.

Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто существующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.

Для выявления каких инфекций используется метод ПЦР?

Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т. д.).

В урологической и гинекологической практике —

• для выявления хламидиоза,
• уреаплазмоза,
• гонореи,
• герпеса,
• гарднереллёза,
• микоплазменной инфекции,
• ВПЧ — вирусов папилломы человека;

В пульмонологии —

• для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний,
• туберкулёза;

В гастроэнтерологии —

• для выявления хеликобактериоза;

В клинике инфекционных заболеваний —

• в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллёза,
• дифтерии,
• вирусных гепатитов В, С и G;

В гематологии —

• для выявления цитомегаловирусной инфекции,
• онковирусов.

Исследуемый биоматериал

Для ПЦР-диагностики заболеваний на анализ берут разные виды биоматериала. Выбор зависит от типа инфекции.

При анализе на ЗППП методом ПЦР берут соскоб или мазок из шейки матки или уретры, а также мочу.

Для выявления герпеса, цитомегаловируса, гепатита, токсоплазмоза и ВИЧ на анализ берут кровь.

При анализе на мононуклеоз и цитомегаловирус берут мазок из зева.

Спинномозговая жидкость используется для анализа при поражениях нервной системы, для диагностики внутриутробных инфекций исследуются ткани плаценты, для выявления легочных инфекций — мокрота или плевральная жидкость.

Подготовка к исследованию

Подготовка к ПЦР-диагностике напрямую зависит от типа биоматериала.

Кровь сдается натощак утром.

Моча также сдается утром, в лабораторных условиях, в стерильный контейнер.

Перед сдачей мазка или соскоба из урогенитальной области нельзя вступать в половые контакты за несколько дней до исследования, не следует проводить спринцевания. Мазок или соскоб нельзя сдавать во время менструации и в течение 2-х дней после ее окончания.

ПЦР-диагностика

ПЦР (полимеразная цепная реакция) — метод лабораторной диагности­ки, позволяющий клонировать в условиях пробирки любой участок ДНК любого организма.

Основные преимущества метода

1.     Высокая чувствительность и специфичность.

2.     Высокая скорость получения результатов анализа.

3.     Выявление некультивируемых и труднокультивируемых форм микроорганизмов.

4.     Возможность количественного измерения (вирусная нагрузка).

5.     Выявление микроорганизмов в период серонегативного окна (во время инкуба­ционного периода и при тяжелых иммунодефицитах).

6.     Количественные исследования условно-патогенных микроорганизмов в качестве альтернативы бактериологическому титру при использование технологии «ПЦР в реальном времени».

Применение

1.     Акушерство и гинекология: при обследовании беременных на внутриутробные инфекции.

2.     Дерматовенерология: при обследовании на венерические заболевания и инфек­ции, передаваемые половым путем.

3.     Гепатология.

4.     Инфекционные болезни.

Лаборатория ПЦР-диагностики Удмуртского республиканского центра СПИД — единственная в республике, проводящая количественные исследования и генотипирование вируса гепатита С.

Исследования проводятся на самом современном оборудовании французской фирмы «HOFFMAN LA ROCHE» с применением высокочувствительных тест-систем последнего поколения, разработанных в Центральном НИИ эпидемиологии Рос­сийской Федерации.

Отделение ПЦР-диагностики осуществляет следующие виды исследований:

• качественное и количественное определения ВИЧ и парентеральных вирусных гепатитов;
• определение энтеровирусов;
• вируса простого герпеса
• цитомегаловирусной инфекции
• урогенитальных инфекций
• генотипирование вирусов.

Преимущество ПЦР-диагностики заключается в том, что этот метод позволяет выявлять инфекцию на ранних стадиях заражения, когда другие методы исследования еще дают отрицательный результат. Это позволяет начать лечение на начальных этапах заболевания и избежать хронизации процесса и других неприятных осложнений.

Лаборатория ПЦР-диагностики Центра является единственной в республике, проводящей количественные исследования и генотипирование вируса гепатита С, что позволяет лечащим врачам выбрать для пациентов лекарственные препараты с учетом чувствительности данного генотипа вируса и оценить эффективность лечения в динамике.

Что такое ПЦР и почему это «золотой стандарт» в молекулярной диагностике?

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) ¹ , признанная одним из важнейших научных достижений 20-го века, представляет собой быстрый и простой способ создания неограниченных копий ДНК из одной исходной цепи. Эти миллионы копий участка ДНК создаются всего за несколько часов с целью воссоздать достаточно ДНК для различных целей тестирования, таких как секвенирование или идентификация инфекции.Он также используется для безопасности пищевых продуктов, судебной медицины, эпидемиологии и многих других дисциплин, помимо диагностических тестов.

В ПЦР-тестировании есть два важных компонента — праймеры и зонды.

• Праймеры — это короткие последовательности нуклеотидов, из которых состоит наша ДНК, которые связываются вместе уникальным образом. «Праймер» — это начальная точка или участок ДНК, который идентифицируется для копирования. Используются два праймера, которые связаны с каждым концом нашей матричной ДНК.Затем область между этими праймерными областями реплицируется полимеразой. Подобно копировальному аппарату, он печатает последовательность снова и снова, создавая значительное количество генетического материала.
• Зонды очень специфично связываются с амплифицированным материалом после репликации и излучают световой сигнал, который можно обнаружить. Чем больше присутствует последовательность (от репликации), тем больше света она будет давать, обеспечивая более четкую картину для более точного теста. Очень специфическая природа связывания праймеров и зондов производит этот свет, и генерируемое количество дает нам уверенность в определении положительных или отрицательных результатов.

«Золотой стандарт» относится к высочайшему качеству или эталону конкретной практики, продукта или технологии. Понимая это определение, технология ПЦР считается эталоном во многих аспектах диагностического тестирования, поскольку теоретически может идентифицировать и обнаруживать цель с помощью единственной копии, присутствующей в образце. Идеальная диагностика является одновременно специфической и чувствительной, что означает, что цели, даже при чрезвычайно низкой концентрации, положительные и ложноотрицательные результаты не проскальзывают через трещины.Например, один ген, обнаруживающий хламидиоз, может быть не так хорош, как два гена, специфичных для хламидиоза.

Несколько целей в дизайне теста, если они положительные, дают больше уверенности в правильности диагноза. Технология ПЦР также является быстрой и может выполняться от часов до минут по сравнению с традиционными методами, такими как культивирование, которые являются трудозатратными и могут занять несколько дней для получения результата

Другие методы диагностического тестирования, такие как посев или серология, могут не обеспечивать такой же уровень чувствительности, как ПЦР.Следовательно, риск ложноотрицательных результатов возрастает в критических сценариях тестирования, когда организмы или вирусы могут быть трудными для роста или обнаружения иммунного ответа. Вот почему многие специалисты диагностического сообщества считают ПЦР золотым стандартом. Компания Roche Diagnostics имеет долгую историю создания высококачественных молекулярных тестов на основе ПЦР для широкого спектра заболеваний и использовала эту технологию для быстрой разработки теста SARS-CoV-2 в ответ на развивающуюся пандемию.

в диагностике и лечении инфекций центральной нервной системы | Инфекционные болезни | JAMA Neurology

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это широко применяемый лабораторный тест для диагностики широкого спектра заболеваний центральной нервной системы (ЦНС), включая генетические и аутоиммунные заболевания, злокачественные новообразования и инфекции. ^{1 , 2} Обладая способностью обнаруживать незначительные количества ДНК или РНК, содержащихся в тканях или жидкостях, ПЦР повысила скорость и точность диагностики, улучшила понимание патогенеза и помогла выявить инфекционные причины заболеваний, ранее считавшихся идиопатическими. Кроме того, ПЦР можно проводить на различных тканях, сохраняемых по-разному — даже архивные образцы можно использовать для получения важной эпидемиологической информации. Быстрая и точная диагностика позволяет назначить соответствующее лечение и избежать ненужных или инвазивных исследований.

Сила ПЦР является результатом ее способности синтезировать миллионы копий определенного сегмента гена in vitro, начиная с одной или только нескольких копий матрицы, количество которых невозможно обнаружить другими методами. Метод ПЦР проиллюстрирован на рисунке 1. После того, как последовательность интересующего сегмента ДНК идентифицирована (матрица), выбираются 2 синтетических олигонуклеотида (праймера), последовательность которых комплементарна каждой цепи ДНК, подлежащей амплификации.Эти праймеры обычно имеют длину от 20 до 40 оснований. На первом этапе требуется денатурация двухцепочечной ДНК-матрицы путем ее нагревания до 92–95 ° C. Как только это произойдет, праймеры будут отжигаться с соответствующими дополнительными цепями матрицы после охлаждения до 55-70 ° C. Чтобы максимизировать отжиг праймер-матрица по сравнению с повторным отжигом матрица-матрица, праймеры поставляются в большом количестве; таким образом, доступно больше праймеров для связывания, чем цепей ДНК de novo. Связывание праймеров с матрицей — это только первый шаг.Чтобы построить новую цепь ДНК, комплементарную матрице, необходимы 2 основных ингредиента: нуклеотиды (аденин, гуанин, тимидин, цитозин) и фермент, катализирующий их связывание (ДНК-полимераза). Предоставляя нуклеотиды в огромном молярном избытке и используя термостабильную ДНК-полимеразу (обычно Taq полимераза), новая комплементарная последовательность ДНК ниже отожженного праймера собирается, в результате чего образуются 2 полные пары двухцепочечной ДНК. Это завершает первый цикл.Множественные циклы (обычно 30-40) денатурирования, отжига новых праймеров и удлинения цепи в конечном итоге дают более 1 миллиарда копий исходной ДНК-матрицы за 2-3 часа. Вся реакция завершается в автономном термоциклере с использованием очень малых объемов (микролитров) реагентов и образца.

Когда важно знать не только то, что ген (ДНК) присутствует, но также и то, что он экспрессируется и транскрибируется в информационную РНК (мРНК), или когда РНК-вирусы являются целью обнаружения, вариант ПЦР, называемый обратным можно использовать ПЦР с транскриптазой (ОТ-ПЦР).Общий принцип идентичен изложенному выше, но вместо полимеразы Taq используется фермент с активностью обратной транскриптазы, который сначала выполняет обратную транскрипцию мРНК в комплементарную ДНК. Комплементарная ДНК затем служит в качестве матрицы, из которой амплифицируется интересующий сегмент. Ситуации, в которых это может быть важно, включают заболевания, вызванные генетическими дефектами с переменной пенетрантностью, или вирусные инфекции, в патогенезе которых играет роль как латентная, так и литическая инфекция (например, герпесвирусы).

Продукты амплификации ПЦР можно обнаружить с помощью различных методов. Продукты могут быть загружены в агарозный гель, окрашенный бромидом этидия, а затем подвергнуты электрофорезу, что позволяет осуществить миграцию продукта ДНК в его предполагаемое место в геле на основе размера образованного фрагмента (определяемого расстоянием между 2 выбранными праймерами). Однако, чтобы убедиться, что эти продукты являются специфичными, необходимо провести Саузерн-блоттинг. В этом процессе целевая ДНК переносится и иммобилизуется на мембране, а затем маркируется дополнительным зондом, к которому прикреплен радиоактивный, флуоресцентный или колориметрический маркер.Дополнительный метод, который можно использовать для повышения специфичности продуктов, называется вложенной ПЦР . В этом методе второй раунд ПЦР выполняется с использованием праймеров, внутренних по отношению к исходным праймерам, таким образом идентифицируя только подмножество продуктов амплификации, которые соответствуют целевому фрагменту. Вложенная ПЦР также может использоваться для повышения чувствительности ПЦР. Возможно, лучшим стандартом для обеспечения специфичности является секвенирование продуктов ПЦР и сравнение последовательности с известной последовательностью целевого гена.Однако секвенирование продуктов ПЦР обычно не выполняется в качестве рутинной процедуры, и его использование в значительной степени ограничивается первоначальной проверкой анализов ПЦР и в качестве инструмента исследования.

Синтез неспецифических продуктов может привести к ложноположительным результатам ПЦР, если не будут предприняты соответствующие шаги для подтверждения специфичности. Может произойти неправильный запуск (связывание праймеров с неправильной областью ДНК), но это можно свести к минимуму, увеличив «жесткость» условий реакции, и можно обнаружить, если не удается найти амплифицированный материал с помощью саузерн-блоттинга.Ложноположительные результаты ПЦР также могут возникать из-за загрязнения реакций нуклеиновой кислотой либо продуктами предыдущих реакций (переход), либо присутствующими в лабораторных условиях. Опытные лаборатории принимают всесторонние меры предосторожности, чтобы избежать источников непреднамеренного заражения, включая надлежащий дизайн лабораторных помещений и протоколы работы с образцами. Отрицательные контроли используются во всех запусках реакций для обнаружения непреднамеренного загрязнения.

Актуальность для практики неврологии

Существует множество областей, в которых ПЦР может непосредственно применяться в клинической практике. ² В этом обзоре мы сосредоточимся на применении ПЦР для диагностики и лечения инфекционных неврологических заболеваний. ^{2 , 3}

Вирусы являются распространенными возбудителями некоторых неврологических заболеваний (например, менингита, энцефалита и миелита). Выделить многие вирусы стандартными методами культивирования клеток сложно, а зачастую и невозможно. Даже для вирусов, таких как энтеровирусы, которые обычно более поддаются культивированию, для точной идентификации может потребоваться продолжительный период (часто до 8 дней).Ложноотрицательные культуры являются обычным явлением и могут встречаться в 25–35% образцов, а некоторые серотипы энтеровирусов вообще не растут в культуре клеток. В случае энцефалита, вызванного вирусом простого герпеса (ВПГ), у взрослых вирус почти никогда не обнаруживается в спинномозговой жидкости (ЦСЖ) при культивировании. В результате этих проблем до широкого использования ПЦР-теста спинномозговой жидкости в вирусной диагностике пациенты часто получали ненужную эмпирическую противомикробную терапию в течение длительных периодов времени и подвергались инвазивным диагностическим процедурам, таким как биопсия головного мозга.Серологическая диагностика вирусных инфекций ЦНС ограничивается, прежде всего, временем, необходимым для обнаружения высоких уровней продукции специфических антител (часто 2-3 недели от начала заболевания), или повсеместной серопозитивностью к определенным вирусам (например, HSV). Косвенные доказательства вирусной инфекции, такие как стул или респираторная экскреция, могут быть полезны, но они не обязательно коррелируют с активным заболеванием ЦНС (например, периодическое выделение цитомегаловируса с мочой или респираторным секретом, а также длительное выделение энтеровирусов возникают при бессимптомном течении болезни. лиц).Полимеразная цепная реакция привлекательна тем, что позволяет обойти большинство этих ограничений. В таблице 1 представлен широкий спектр вирусных инфекций ЦНС, для которых клинически применима ПЦР. По мере выявления более специфических противовирусных соединений, которые можно использовать в терапевтических целях, точная диагностика будет становиться все более важной.

Помимо вирусных инфекций, ПЦР также использовалась для диагностики бактериальных, микобактериальных, риккетсиозных и протозойных инфекций ЦНС (таблица 2).

Часто сложно точно определить чувствительность и специфичность ПЦР при инфекциях ЦНС, потому что в некоторых ситуациях ранее используемые стандарты диагностики оказываются менее чувствительными, чем ПЦР. Существующие стандарты, такие как вирусный посев спинномозговой жидкости, часто бывают нечувствительными и медленными. В некоторых случаях окончательный диагноз был основан на инвазивных процедурах, таких как биопсия головного мозга, которая могла быть выполнена только у тяжелобольных пациентов, потенциально создавая искаженную картину тяжести или характера заболевания (например, энцефалит, вызванный вирусом простого герпеса).Несмотря на крайнюю чувствительность ПЦР, все же случаются ложноотрицательные результаты. В случае большинства вирусных инфекций самые высокие уровни нуклеиновой кислоты присутствуют остро и обычно снижаются при лечении или с течением времени. Задержка в проведении ПЦР может привести к ложноотрицательным результатам. Ингибиторы ПЦР могут присутствовать в жидкостях или тканях организма и могут приводить к ложноотрицательным результатам. В спинномозговой жидкости наиболее часто встречающимися ингибиторами являются гемовые продукты, возникающие в результате распада эритроцитов. Небольшое количество эритроцитов в образцах спинномозговой жидкости не препятствует ПЦР, но это может быть проблемой для образцов спинномозговой жидкости, сильно загрязненных кровью.В образцах с высоким уровнем белка или высоким числом лейкоцитов ингибирования не отмечено. В отличие от других образцов, CSF имеет тенденцию иметь низкие концентрации эндонуклеаз / экзонуклеаз и белков, которые могут ингибировать действие полимеразы.

Полимеразная цепная реакция может быть проведена с использованием всего 30 мкл спинномозговой жидкости. Полимеразные цепные реакции лучше всего проводить на свежих образцах спинномозговой жидкости, хотя кратковременное (дни) хранение спинномозговой жидкости при температуре холодильника, по-видимому, существенно не снижает диагностическую ценность.Положительные результаты ПЦР были получены для образцов спинномозговой жидкости, которые были заморожены в течение многих лет, но снижение чувствительности с течением времени тщательно не исследовалось. В целом ДНК оказывается более стабильной при хранении, чем РНК, которая более подвержена деградации. Наконец, короткие курсы (например, несколько дней) антимикробной терапии, по-видимому, не оказывают значительного влияния на результаты ПЦР, что является большим преимуществом по сравнению с методами культивирования, при которых диагностические результаты часто резко падают даже после коротких периодов антимикробной терапии.

Другие клинические применения и актуальность для исследования нейробиологии

Помимо помощи в диагностике инфекционных заболеваний, ПЦР может использоваться для множества других целей. Полимеразная цепная реакция может облегчить дифференциальную диагностику между рецидивирующей вирусной инфекцией, которая, как ожидается, будет положительной на ПЦР, и постинфекционным иммуноопосредованным заболеванием, которое отрицательно на ПЦР.Например, после противовирусной терапии энцефалита, вызванного вирусом простого герпеса, у некоторых пациентов наблюдается клинический рецидив. Положительный результат ПЦР CSF HSV предполагает, что это вызвано рецидивирующей вирусной инфекцией, и поддерживает возобновление противовирусной терапии. Отрицательный результат ПЦР соответствует постинфекционному иммуноопосредованному процессу, и дополнительная противовирусная терапия редко имеет ценность. Полимеразная цепная реакция может использоваться для идентификации детерминант лекарственной устойчивости путем секвенирования ПЦР-амплифицированных генов, кодирующих мишени для противовирусной терапии.Например, ПЦР-амплификация и секвенирование выбранных вирусных генов у пациентов с инфекцией вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) может помочь выявить мутации, которые коррелируют с устойчивостью к специфическим антиретровирусным препаратам. Поскольку методы ПЦР стали более сложными, теперь во многих случаях стало возможным точно определить количество нуклеиновой кислоты, присутствующей в образце, а не просто обеспечить качественное определение. Количественная ПЦР может оказаться полезной для мониторинга продолжительности и адекватности терапии или для получения прогностической информации о заболевании.Качественная ПЦР все чаще используется для изучения инфекции ЦНС, вызванной ВИЧ и ВПГ. В случае неонатального энцефалита, вызванного вирусом простого герпеса, качественная ПЦР привела к изменению рекомендованной дозировки и продолжительности терапии ацикловиром и привела к более широкому использованию дополнительной пероральной терапии после первичной внутривенной противовирусной терапии. В случае ВИЧ-инфекции количественное определение вирусной нагрузки в спинномозговой жидкости активно исследуется как потенциальный маркер риска и тяжести ВИЧ-ассоциированной энцефалопатии.Полимеразная цепная реакция также может помочь определить потенциальную роль вирусов или других микробных патогенов в неврологических и психических заболеваниях с неопределенными причинами, включая шизофрению, рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера и другие нейродегенеративные заболевания. Одним из интересных результатов первоначальных исследований в этой области является частота, с которой нуклеиновая кислота, соответствующая множеству вирусных патогенов, может быть идентифицирована в ткани мозга даже у пациентов без известных неврологических заболеваний.Напротив, результаты ПЦР ЦСЖ почти всегда отрицательны у бессимптомных лиц без известных неврологических заболеваний. В случае CSF положительные результаты ПЦР почти всегда коррелируют с наличием клинически значимого заболевания. Значение положительных результатов ПЦР в ткани мозга следует интерпретировать с большой осторожностью, пока не будут выяснены природа, значение и частота «нормальной геномной флоры мозга», идентифицированной с помощью ПЦР.

Принята к публикации 8 января 1999 г.

Это исследование было поддержано грантами программы Merit Review and Research Enhancement Award от Департамента по делам ветеранов, Вашингтон, округ Колумбия; по гранту DAMD17-98-8614 от армии США, Вашингтон, округ Колумбия; и грантом 5R01AG14071 Национального института старения, Бетесда, Мэриленд (доктор Тайлер).

Мы благодарим Адриану Вайнберг, доктор медицины, за ее вдумчивые комментарии.

Автор, ответственный за переписку: Кеннет Л. Тайлер, доктор медицины, отделение неврологии, B-182, Центр медицинских наук Университета Колорадо, 4200 E Девятая авеню, Денвер, CO 80262 (электронная почта: [email protected]).

Будущее ПЦР-диагностики

Полимеразная цепная реакция (ПЦР), удостоенная Нобелевской премии ^{1 Метод} произвел революцию в молекулярной биологии своим изобретением в 1986 году, и он сделал то же самое в медицинской диагностике за последние 15 лет. Возможность копировать и размножать определенные целевые молекулы ДНК открыла дверь для быстрой, точной диагностики заболеваний во многих областях и с меньшими затратами со временем.

ПЦР создает неограниченное количество копий ДНК только из одной исходной цепи с использованием ферментов полимеразы, праймеров (небольших последовательностей ДНК, которые определяют ДНК, подлежащую амплификации) и нескольких термических циклов. Достижения произошли в 1980-х годах с использованием бактериальных ферментов, способных выдерживать высокие температуры, а в 1991 году технология была приобретена фармацевтическим гигантом Roche, который начал совершенствовать науку для использования в медицинской диагностике.

Преимущества ПЦР

«Современные методы [культивирования] могут быть довольно трудоемкими и иногда могут занимать дни или недели, тогда как количественные методы ПЦР могут дать вам ответы в течение нескольких часов.Это может быть намного быстрее и надежнее », — говорит Ребекка Сандерс, ученый-метролог из компании LGC, Теддингтон, Великобритания. ПЦР-диагностика выполняется быстрее и менее подвержена перекрестному заражению, поскольку этот метод обычно проводится в автоматических термоциклах. Он также более чувствителен и специфичен, чем иммуноанализ на планшетах.

В некоторых случаях ПЦР становится предпочтительным методом диагностики. Например, этот метод был одобрен Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) для быстрой диагностики туберкулеза легких (ТБ) ² взамен стандартного метода микроскопии мазка мокроты, разработанного более века назад.ПЦР или тесты амплификации нуклеиновых кислот (NAAT) дают быстрые результаты, и это позволяет использовать их в полевых условиях для ранней диагностики ТБ, что важно для предотвращения распространения болезни.

Возможности ПЦР-диагностики огромны. «Было бы проще определить, где ПЦР не будет использоваться — все на этой планете имеет геном ДНК или РНК, поэтому, если вы хотите что-либо обнаружить, вы переходите к ПЦР», — объясняет Джонатан О’Халлоран, главный научный сотрудник QuantumDx. стартап по ПЦР-диагностике, базирующийся в Ньюкасле, Великобритания.Он добавляет, что, помимо клинических применений, ПЦР-диагностика также может стать важной в таких отраслях, как пищевая и сельскохозяйственная. Еще одним преимуществом диагностики ПЦР является их использование в мультиплексных анализах — амплификация нескольких мишеней в одном эксперименте ПЦР путем простого использования нескольких пар праймеров. Это может быть полезно при диагностике инфекционных агентов, симптомы которых сложно охарактеризовать. В одном тесте можно охватить до 20 патогенов. ³

Арон Коэн, главный исполнительный директор лондонского отделения диагностики.ai, говорит, что в нынешней экосистеме ПЦР-диагностики в настоящее время преобладает лабораторное тестирование, «на данный момент существует очень мало тестов, одобренных FDA, возможно, 10 различных тестов имеют одобрение FDA (например, для ВИЧ) и полностью автоматизированы, но для подавляющего большинства люди полагаются на тесты, разработанные в лаборатории ».

КПЦР впереди

Большинство диагностик будет основано на количественной ПЦР в реальном времени или на количественной ПЦР (qPCR). ⁴ Он работает за счет использования флуоресцентно меченных олигонуклеотидных зондов и мониторинга флуоресценции после каждого цикла — интенсивность сигнала отражает количество амплифицированной ДНК, а количество циклов, в которых флуоресценция впервые обнаруживается, используется для расчета начального числа молекул ДНК в образце после калибровки системы.

Признавая важность молекулярной диагностики для ранней диагностики опасных для жизни инфекций, Bruker недавно запустила ПЦР в реальном времени для инвазивных грибковых заболеваний. Fungiplex® Aspergillus и Fungiplex® Candida обнаруживают ДНК Aspergillus и Candida соответственно, прямо из образцов пациентов, что позволяет на ранней стадии диагностировать инвазивное заболевание, не дожидаясь посева грибкового патогена. Тогда для улучшения результатов лечения пациентов может быть назначена таргетная противогрибковая лекарственная терапия.

КПЦР также адаптирован для обнаружения РНК-вирусов, таких как ВИЧ и гепатит С, и анализа транскриптов РНК, связанных с некоторыми видами рака. В двухэтапной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) молекулы РНК преобразуются в их последовательности комплементарной ДНК (кДНК) ферментами обратной транскриптазы с последующей амплификацией кДНК с помощью стандартной ПЦР. Разрабатываемый новый сверхбыстрый метод может обещать более эффективный процесс, особенно при анализе большого количества образцов.В этом методе используется генетически модифицированная термостабильная обратная транскриптаза, поэтому процесс ПЦР может происходить непосредственно с РНК. ⁵

Преодоление ограничений

Но есть также ограничения, связанные с ПЦР-диагностикой, «все дело в пробоподготовке с помощью ПЦР, в отличие от иммунодиагностики, где вы можете по существу использовать образец сырой сыворотки крови, для ПЦР-диагностики вы требуете. провести сложную пробоподготовку », — говорит О’Халлоран. Многие органические и неорганические вещества будут ингибировать ПЦР, поэтому их необходимо удалить, и эти дополнительные стадии усложняют процедуру.

Ряд компаний и академических групп изучают технологии для улучшения ПЦР-диагностики. Люк Ли, профессор биоинженерии Калифорнийского университета в Беркли, разрабатывает альтернативный метод температурного цикла. Он изобрел способ более быстрого изменения температуры — с помощью плазмоники — взаимодействия света с электронами на поверхности металла, которые генерируют тепло. Светодиоды нагревают 120-нм золотую пленку в контакте с раствором ДНК в микрожидкостном отсеке. Механизм позволял переключаться с 55 ° C на 95 ° C, 30 раз за 5 минут.

Компания O’Halloran’s QuantumDx выпустила портативное настольное устройство, которое может сократить время теста до 7 минут и имеет улучшенную чувствительность менее 1 клетки на мл — огромное улучшение по сравнению со стандартными методами, которые составляют около 150 клеток на мл. Это было достигнуто с помощью интеллектуальной микрофлюидики и технологии полевых транзисторов с нанопроволокой. ⁷ «Мы решаем некоторые проблемы чувствительности с помощью действительно новой физики, называемой диэлектрофорезом», — объясняет О’Халлоран.Это явление вызывает силу, действующую на частицу в неоднородном электрическом поле, и позволяет точно захватить интересующие клетки из необработанного образца: «Мы устанавливаем электрические поля с частотой и величиной, которые вызывают дипольные моменты, в частности, в представляющую интерес клетку, и мы используем микрожидкости для высвобождения этих концентрированных клеток в нашу ПЦР ».

В крупных диагностических лабораториях большая часть ПЦР проводится с помощью автоматизированных, роботизированных высокопроизводительных систем. Но стандартизация и контроль качества ПЦР по-прежнему требует кропотливого участия человека.Инновационный стартап Diagnostics.ai придумал решение с использованием искусственного интеллекта. «Мы эффективно загружаем обучающую машину контролируемым набором данных, набором входных данных с кучей известных результатов, а обучающаяся машина автоматически проверяет себя и гарантирует, что она может регулярно давать те же результаты — то, что невозможно сделать без ручного ввода в текущих систем из-за вариабельности ПЦР в реальном времени для разных платформ и анализов », — говорит Коэн. После того, как их система настроена, о результатах можно будет сообщить почти сразу, и это будет только сигнализировать о неожиданных результатах, требующих дальнейшего анализа.Система тестируется крупнейшим поставщиком услуг патологии Великобритании Viapath в одной из своих ведущих лабораторий.

Цифровая точность

Изобретенная в начале 1990-х годов, но вытесненная qPCR в 1996 году, цифровая PCR теперь вернулась в специализированные приложения. Этот метод не требует стандартной калибровки, но работает путем разделения исходного образца на большое количество отдельных лунок перед амплификацией, так что в каждой лунке будет либо 1, либо 0 молекул ДНК (отсюда цифровая).После амплификации простой подсчет положительных или отрицательных лунок может определить абсолютное количественное определение. ⁸

«Цифровая технология обеспечивает уровень точности, которого невозможно достичь с помощью количественной ПЦР», — говорит Сандерс, но О’Халлоран отмечает, что «это откровенно избыточно для большинства клинических приложений». Это полезно, когда вам нужно точно знать, сколько цели находится в вашем образце. «Например, есть некоторые виды рака, которые вызваны множественными копиями одного и того же гена, поэтому изменение количества копий и знание количества копий могут изменить режим лечения», — объясняет Сандерс.Она говорит, что в настоящее время в большинстве больниц нет доступа к подобному оборудованию; «стоимость должна снизиться, и это произойдет, если на рынке появится больше платформ».

Взгляд в будущее

ПЦР-диагностика также окажет большое влияние на будущий рост прецизионной медицины — индивидуальный подход к лечению индивидуального пациента. О’Халлоран говорит, что QuantumDx уже разработали тест на варфарин. Антикоагулянтный препарат выбора на протяжении десятилетий, его недавно заменили дорогостоящими альтернативами из-за риска тромбоза и других осложнений у части пациентов.«Расходы на [антикоагулянты] ежегодно растут на сотни тысяч фунтов, — говорит О’Халлоран, — но« мы разработали тест, который позволяет нам проводить быстрое тестирование на пациентах, а затем сообщать врачу, кто может принимать варфарин (это 75% нашего населения) ».

В конечном счете, О’Халлоран рассматривает ПЦР-диагностику как нечто, что расширится до первичной медико-санитарной помощи:« вы собираетесь увидеть ее в кабинете врача и в аптеке, она поможет. будет действительно захватывающим временем для ПЦР ». QuantumDx работает над переносным устройством для ПЦР, и он предполагает, что однажды он может оказаться в нашей домашней аптечке рядом с термометром:« Я не вижу причин, по которым это невозможно. произойдет в ближайшие 10 лет.’

Ссылки

¹ Mullis KB и Faloona FA« Специфический синтез ДНК in vitro с помощью цепной реакции, катализируемой полимеразой ». Методы в энзимологии vol. 155 (F) pp. 335–50 (1987)

² Boehme et al. 2010. Быстрая молекулярная диагностика туберкулеза и устойчивости к рифампину. N Engl J Med. 363: 1005-1015, DOI: 10.1056 / NEJMoa0907847

³ Пол К. Шрекенбергера и Александр Дж. МакАдамб. Точка-контрапункт: большие мультиплексные панели ПЦР должны быть тестами первой линии для обнаружения респираторных и кишечных патогенов.J. Clin. Microbiol. Октябрь 2015 г. 53 нет. 10 3110-3115. DOI: 10.1128 / JCM.00382-15

⁴ Петр Кралик и Маттео Рикки. Базовое руководство по ПЦР в реальном времени в микробной диагностике: определения, параметры и все остальное. Front Microbiol. 2017; 8: 108. doi: 10.3389 / fmicb.2017.00108

⁵ Петра Хованцова, Верена Мерк, Андреас Маркс, Марсель Лейст, Рамон Кранастер; Количественная ПЦР с обратной транскрипцией непосредственно из клеток без экстракции РНК и без изотермической обратной транскрипции: протокол RT-qPCR с нулевым шагом, биологические методы и протоколы, том 2, выпуск 1, 1 января 2017 г., bpx008, https: // doi.org / 10.1093 / biomethods / bpx008

⁶ Джун Хо Сон, Бюнгрэ Чо, Сун Гвен Хонг, Сан Хун Ли, Ори Ходжа, Аманда Дж. Хаак и Люк П. Ли. Сверхбыстрая фотонная ПЦР. Свет: Наука и приложения, том 4, страница e280 (2015) doi: 10.1038 / lsa.2015.53

⁷ http://quantumdx.com/systems/q-poc

⁸ Джим Ф. Хаггетт, Александра Уэйл . Цифровая ПЦР как новая технология и ее потенциальное значение для молекулярной диагностики. Клиническая химия.2013, 59 (12) 1691–1693; DOI: 10.1373 / Clinchem.2013.214742

Что такое ПЦР-тестирование? — Служба здравоохранения Юго-Западного Вермонта

Вероятно, только с начала пандемии COVID-19 вы слышали о тестировании методом ПЦР. Но, в отличие от многих новых тестов, используемых для обнаружения COVID-19, ПЦР-тестирование используется для точной медицинской диагностики уже почти 30 лет.

До этого момента лабораториям было трудно обнаружить вирус или бактерии в образце, потому что их было слишком мало. Клонирование заняло недели или месяцы. Ученым был нужен способ повысить обнаруживаемость небольших количеств патогенов за меньшее время.

Примерно в это время, в 1983 году, Кэри Б. Маллис, работавшая химиком в Cetus Corporation, биотехнологической фирме в Калифорнии, фактически искала другой способ создания новых диагностических тестов.В качестве побочного эффекта одного из его экспериментов он непреднамеренно удвоил ДНК патогена.

После долгой недели в лаборатории он ехал в свою горную хижину в округе Мендосино, когда ему в голову пришла эта идея. Если бы он мог повторять эти шаги и каждый раз удваивать ДНК, он бы повысил обнаруживаемость патогена.

«В моей каюте были диаграммы реакций ПЦР на каждой поверхности, на которую можно было бы нанести карандаш или мелок», — вспоминает Кэри в видео от Biosearch Technologies, компании, которая производит синтезатор ДНК, который Маллис использовал для проверки своей гипотезы.«Я проснулся в новом мире».

Он назвал это полимеразной цепной реакцией или ПЦР. Он полагался на ферменты и температурный цикл, увеличивая и уменьшая температуру снова и снова, чтобы генерировать миллионы копий ДНК за сравнительно короткое время.

Престижные научные журналы Nature и Science отклонили его статью на эту тему для публикации, но к 1987 году все больше ученых говорили о потенциале этой новой реакции.Он подвергся усиленному изучению и усовершенствованию.

К 1988 г. мультиплексная ПЦР позволила тесту обнаруживать несколько мишеней за одну реакцию. К 1992 году ученые смогли измерить амплификацию ДНК в реальном времени по мере развития реакции. А в 1993 году Маллису была присуждена Нобелевская премия по химии, в том же году первый диагностический тест ПЦР был одобрен FDA.

В своей благодарственной речи он сказал: «Инновации также, на первый взгляд, часто отмечены небольшим количеством безумия.Если никто громко не упоминает, что думают, что вы сошли с ума, то вы, вероятно, не проявляете новаторства ».

С тех пор ПЦР претерпела множество улучшений. Открытие нового фермента, способного выдерживать высокие температуры, потребовало добавления новых ферментов с каждым тепловым циклом. Это нововведение и разработка новых ферментов сделали процесс быстрее, проще и конкретнее. Дополнительные химические инновации сделали реакцию еще более конкретной и безопасной для ученых, которые ее используют.

ПЦР произвела революцию в диагностике генетических дефектов, СПИДа, гепатитов B и C. Она используется для обнаружения кишечной палочки, вредных бактерий, во время тестирования безопасности пищевых продуктов. В 2009 году он использовался для мониторинга пандемии h2N1, а к 2012 году FDA одобрило более 100 молекулярных диагностических тестов на основе ПЦР для использования в улучшении лечения рака. И список продолжается. ПЦР использовалась для выявления сальмонеллы, малярии и клещевого бабезиоза. Он используется для выявления генетических и аутоиммунных заболеваний.

Для той же цели появились и другие методы амплификации, но в настоящее время ни один из них не получил широкого клинического применения. Тот же метод, который изначально отвергался научным руководством, теперь появился почти в полумиллионе рецензируемых статей, в то время как количество публикаций, содержащих другие методы усиления, немногим превышает 1000.

Интересно, что помимо значительного вклада в медицину, ПЦР позволила добиться огромных успехов в криминологии и археологии, где усиление небольших количеств ДНК помогает поймать преступников и раскрыть тайны нашего древнего прошлого.

Сегодня ПЦР считается одним из самых значительных научных достижений 20 века. Это остается самой клинически проверенной технологией молекулярной диагностики в мире. Благодаря Муллису и его уважаемым коллегам мы можем быстро и точно обнаруживать COVID-19.

Карен Бонд руководит лабораторными услугами в Медицинском центре Юго-Западного Вермонта в Беннингтоне, штат Вирджиния.

5270

Стандартный тест на коронавирус, если он доступен, работает хорошо, но могут ли новые методы диагностики помочь в этой пандемии? | Наука

Врач в Германии готовит мазок для анализа на коронавирусную инфекцию.

Автор Роберт Ф. Сервис 22 марта 2020 г. 12:15

По мере того, как Соединенные Штаты стремятся активизировать тестирование на пандемический коронавирус с использованием технологии, основанной на проверенной временем полимеразной цепной реакции (ПЦР), начинают разворачиваться альтернативные подходы, которые могут упростить и ускорить изучение людьми того, нужно ли они были инфицированы.Некоторые методы модифицируют стандартный тест ПЦР, который усиливает крошечные кусочки генетического материала для обнаружения, тогда как другие секвенируют вирус напрямую или используют редактор генома CRISPR.

Грядут более быстрые и дешевые тесты, — говорит Эван Джонс, генеральный директор OpGen, компании по быстрой диагностике. Однако, добавляет он, разработка новых видов тестов «займет время». Некоторые из новых тестов уже поступают в онлайн, но для проверки других, вероятно, потребуются месяцы, и они будут готовы к широкому распространению.

«Тестирование, тестирование, тестирование» — это мантра, которую снова и снова повторяет Генеральный директор Всемирной организации здравоохранения Тедрос Адханом Гебрейесус. Диагностические тесты, выявляющие активные инфекции у людей, жизненно важны для усилий общественного здравоохранения, а не только для здоровья людей. Широко распространенное диагностическое тестирование, наряду с изоляцией инфицированных, отслеживанием контактов и помещением в карантин этих контактов, похоже, сыграло ключевую роль в работе Южной Кореи по подавлению распространения вируса.

Связанные

В Соединенных Штатах медленное развертывание ПЦР-тестов на коронавирус широко объясняется сочетанием строгих правил, направленных на обеспечение их надежности, и сложной сети компаний и систем здравоохранения, ответственных за разработку, проведение и оплату тестов. Администрация Трампа заявляет, что тестирование ускоряется. 16 марта на пресс-конференции в Белом доме У.Заместитель секретаря по вопросам здравоохранения S. Health and Human Services Бретт Гироар сказал, что страна сможет обработать 1 миллион тестов к концу недели и 2 миллиона на следующей неделе. Но реальные цифры еще не близки к этому. Согласно данным, собранным в рамках проекта отслеживания COVID, некоммерческого сотрудничества представителей общественного здравоохранения и журналистов по подсчету тестов, проведенных в Соединенных Штатах, по состоянию на 22 марта была проведена 191 541 ПЦР-диагностика, 24 345 из которых оказались положительными на вирус.

29 февраля Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) опубликовало новые правила, разрешающие выдачу разрешений на использование тестов на коронавирус в чрезвычайных ситуациях помимо тех, которые производятся и распространяются Центрами США по контролю и профилактике заболеваний. Академические вирусологические лаборатории, департаменты здравоохранения и компании начали создавать свои собственные тесты ПЦР. Сегодня около четырех десятков организаций получили одобрение FDA на свои тесты. Среди крупнейших — диагностические компании, такие как Roche Molecular Systems, получившая на этой неделе зеленый свет на проведение испытаний FDA.По словам Александра Валсамакис, главного медицинского директора компании, на начальном этапе она будет предоставлять около 400 000 тестов в неделю в США и 3 миллиона во всем мире. Другие крупные компании также недавно получили одобрение на свои тесты, в том числе Thermo Fisher Scientific и Abbott Laboratories.

университетских вирусологических лабораторий также вмешались, чтобы помочь диагностировать случаи заболевания поблизости от них. Например, на прошлой неделе врачи Медицинского центра Университета Питтсбурга (UPMC) начали использовать самодельный ПЦР-тест для проверки на наличие инфекции в округе Аллегейни.На данный момент количество тестов остается небольшим, около 100 в неделю. «Нам определенно хотелось, чтобы мы начали это раньше, — говорит Алан Уэллс, возглавляющий клинические лаборатории UPMC.

ПЦР — это наиболее часто используемый тест для диагностики коронавируса, поскольку он очень точен. (См. Как работает наиболее распространенный тест на коронавирус?) Но его ограничивают другие проблемы. «Нам не удалось добиться необходимого улучшения», — говорит Стивен Волински, врач-инфекционист Северо-Западного университета. Каждый тест занимает около 4 часов после того, как образец поступает в централизованную лабораторию тестирования, с разделением времени между подготовкой образца и фактическим тестом ПЦР.С транспортом и очередями получение результата может занять от 2 до 4 дней. За это время инфицированные люди могут передать вирус многим другим.

Самостоятельная тампона

В диагностический ландшафт коронавируса добавляется еще одно новое измерение: «домашние» тесты, которые включают отправку образца, взятого дома, в лабораторию. Например, завтра Everlywell планирует начать поставки комплектов на дом и в розничные аптеки. Эти тесты начнутся со скрининговых вопросов в Интернете или в магазине, чтобы определить, вероятно ли, что человек подвергся воздействию вируса.Если да, они могут получить набор для отбора проб из носоглотки по почте или купить его у местного продавца. Человеку будут даны подробные инструкции о том, как ввести свой мазок, вставить его в защитный флакон и в течение ночи отправить его по почте в одну из десятков диагностических лабораторий (которые сотрудничают с Everlywell и уже имеют одобрение FDA) для анализа ПЦР.

Фрэнк Онг, главный медицинский и научный директор Everlywell, говорит, что компания рассчитывает быстро вырасти с тысячи таких тестов в день до десятков тысяч.Хотя каждый тест, вероятно, потребует 4-дневного ожидания результатов, говорит Онг, эта стратегия домашнего отбора проб имеет серьезные преимущества: она защитит медицинских работников от воздействия потенциальной инфекции и высвободит их время. «Нам нужно убедиться, что мы даем им возможность позаботиться о пациентах», — говорит Онг. Другие компании, в том числе Nurx и Carbon Health, заявляют, что теперь они поставляют ограниченные запасы собственных наборов для взятия проб в домашних условиях.

Большинство тестов ПЦР на новый вирус проводится на больших дорогих автоматизированных машинах, которые выполняют множество тестов одновременно.Они есть в крупных больницах или диагностических учреждениях, но сейчас начинает разворачиваться еще один вариант — это небольшие и менее дорогие устройства, которые также выполняют амплификацию нуклеиновых кислот. Они могут использоваться небольшими больницами и даже отдельными врачебными кабинетами.

В пятницу, например, компания Cepheid, которая продает небольшие системы ПЦР для быстрого обнаружения вирусов гриппа, бактерий туберкулеза и других микробов, получила одобрение FDA на экстренное использование тестового картриджа на коронавирус 2 (SARS-CoV-2), который предназначен для экстренного использования в систему GenXpert компании, устройство размером с кофемашину эспрессо, которое может выдать диагностический результат всего за 45 минут.Официальные лица Cepheid говорят, что во всем мире установлено 23 000 таких систем, из них 5000 — в Соединенных Штатах. 19 марта GenMark получил одобрение FDA на экстренное использование собственных тестов на коронавирус, которые проводятся на машинах аналогичного размера, в которых используется запатентованный электрохимический подход для обнаружения целевого генетического материала менее чем за 2 часа. Другие компании, спешащие поставить диагностические аппараты для пунктов оказания медицинской помощи, включают Mesa Biotech, HiberGene, Mobidiag и QuantuMDx.

То же самое и с такими компаниями, как Oxford Nanopore и Fulgent Genetics, которые вместо использования ПЦР напрямую секвенируют любой генетический материал в образце, а затем ищут совпадения, скажем, с новым коронавирусом.Этот подход к высокоскоростному секвенированию генов может помочь охарактеризовать геном коронавируса, чтобы лучше понять, как вирус развивается, но он также может быть диагностическим в определенных ситуациях, таких как удаленные сайты без доступа к ПЦР. Портативные устройства Oxford Nanopore использовались во время вспышек лихорадки Эбола, и компания отправила их в Китай на ранних этапах пандемии.

CRISPR для тестирования

Самый быстрый способ проверки на коронавирус в конечном итоге может быть предложен компаниями, использующими редактор генома CRISPR, более известный тем, что он добавляет или удаляет ДНК в клетках.Две американские компании, Mammoth Biosciences и Sherlock Biosciences, заявляют, что они создали тесты на основе CRISPR и в настоящее время проверяют их на образцах пациентов, прежде чем обращаться за разрешением на экстренное использование в FDA. Метод начинается с образца пациента, извлекается вирусная РНК и используется тест быстрой амплификации нуклеиновых кислот, называемый петлевой амплификацией, чтобы получить ровно столько РНК, чтобы тест мог ее обнаружить. Затем исследователи добавляют два компонента редактора генома CRISPR: белок под названием CAS12, который разрезает ДНК или РНК, и «направляющую» РНК, которая вставляется в CAS12 и помогает ему найти последовательность, соответствующую части генома коронавируса.Если CAS12 и его руководство находят совпадение в РНК, CAS12 связывается с этой согласованной РНК, которая активирует CAS12, чтобы разрезать ее и продолжить разрезать любые другие короткие цепи РНК или ДНК поблизости, включая копии цепи, предназначенные для высвобождения цвета — изменение молекул, когда CAS12 отсекает их. Результатом может быть простое изменение цвета тест-полоски.

Этот метод отлично подходит для поиска небольших фрагментов генетического материала, — говорит Дженнифер Дудна, биохимик из Калифорнийского университета в Беркли, пионер CRISPR, председатель научного консультативного совета Mammoth Biosciences.

В препринте, опубликованном 10 марта на medRxiv, исследователи из Mammoth Biosciences и Калифорнийского университета в Сан-Франциско сообщают, что тесты на клинических образцах дали результаты с точностью, сравнимой с ПЦР, всего за 30 минут. Он использует простую бумажную полоску с цветной линией, которая появляется с положительным результатом. По словам Тревора Мартина, генерального директора Mammoth, компания обсуждает с партнерами производство наборов для тестирования, которые позволят быстро и дешево диагностировать инфекцию SARS-CoV-2 в домашних условиях, не требуя медицинских знаний.

Для завершения теста и получения одобрения регулирующих органов могут потребоваться месяцы, поэтому, скорее всего, он не будет готов в ближайшие критические недели. Но он может быть готов, если распространение коронавируса продолжится. Некоторые предсказывают, что вирус тоже исчезнет, ​​но осенью снова появятся инфекции. Мартин говорит, что для получения результатов не потребуются машины для ПЦР, управляемые обученными специалистами. «Это изменило бы правила игры» в нашей реакции на возникающие болезни, — говорит Мартин.

Проблемы со снабжением

Несмотря на то, что компании и академические лаборатории расширяют свои усилия по диагностике на основе ПЦР, больницы и центры тестирования по всей стране сообщают, что они столкнулись с более серьезным кризисом: у многих заканчиваются химические вещества и другие материалы, которые позволяют проводить тесты, такие как тампоны для сбора образцов у пациентов и реагенты, необходимые для ПЦР.Бенджамин Пински, патолог Стэнфордского университета, который разработал диагностический тест на основе ПЦР, используемый в Северной Калифорнии, говорит, что его лаборатория сталкивается с постоянной нехваткой различных материалов, в первую очередь наборов, используемых для извлечения РНК из вирусных образцов, прежде чем ее можно будет загрузить в ПЦР-машины.

«Это был большой вызов», — говорит Пинский. «Мы должны были быть очень ловкими, чтобы справиться с этим», постоянно меняя поставщиков или даже химические процедуры, которые должны быть проверены, прежде чем их можно будет использовать на образцах пациентов.Его команда даже разослала в Твиттере просьбы к сообществу Стэнфорда и региональным биотехнологическим компаниям с просьбой пожертвовать наборы реагентов, такие как наборы от Zymo и Qiagen. По словам Пинского, даже несмотря на то, что поступают пожертвования, запасов по-прежнему не хватает.

Реагентные компании пытаются ответить. Например, Qiagen, крупный поставщик наборов для экстракции РНК, объявил во вторник, что его сотрудники работают круглосуточно, чтобы увеличить производство с 1,5 миллиона наборов в месяц до 6.5 миллионов в месяц к концу апреля и далее увеличится.

Пинский, например, говорит, что он готов к тому, чтобы компании полностью взяли на себя тестирование на коронавирус у таких ученых, как он сам. «Я надеюсь, что эти компании смогут провести обещанное тестирование», — говорит Пинский. «Это еще предстоит выяснить.»

Что такое ПЦР-тестирование

PCR расшифровывается как «Полимеразная цепная реакция». ПЦР — это давно используемый метод молекулярного диагностического тестирования, используемый для идентификации или нацеливания на генетическую последовательность ДНК или РНК (например,40)). Это то, что делает ПЦР такой удивительно чувствительной. Кроме того, если при разработке теста, специфичного для патогена, проявить должную осторожность, то этот тест редко — если вообще когда-либо — дает ложноположительный результат. Это называется специфичностью.

Поскольку чувствительность и специфичность ПЦР настолько высоки, ПЦР широко считается «золотым стандартом». С точки зрения непрофессионала, это очень точно.

SARS-CoV-2 (возбудитель, вызывающий COVID-19) является возбудителем РНК. Чтобы успешно обнаружить этот патоген с помощью ПЦР, сначала необходимо преобразовать РНК в ДНК, и это делается путем обратной транскрипции РНК в ДНК.Когда ученые комбинируют обратную транскрипцию (ОТ) и ПЦР для амплификации мишеней РНК, это сокращенно называют ОТ-ПЦР. Шаг RT занимает 5-15 минут. Благодаря своей точности ОТ-ПЦР является основным методом, используемым справочными лабораториями для выявления присутствия SARS-CoV-2 (COVID-19) и многих других патогенов.

Несмотря на надежность ПЦР, существует множество конкурирующих химикатов, которые можно использовать для обнаружения патогенов. Два примера — изотермическая амплификация и тесты на основе антигенов. Эти химические процессы, как правило, выполняются быстрее и требуют меньше технических средств.Однако считается, что эти технологии уступают по чувствительности ОТ-ПЦР. Из-за этого они не являются выбором большинства референс-лабораторий, поскольку большинство референс-лабораторий предпочли бы потратить немного больше времени и получить правильный ответ, чем спешить с низкокачественной технологией и подвергнуться более высокому риску ошибочного диагноза.

ПЦР-тесты занимают около часа и дают очень точные результаты. Существуют и другие химические методы (изотермическая амплификация и тесты на антиген), которые могут предложить более быстрые результаты тестов, но они упускают из виду процент случаев, которые могут быть обнаружены с помощью ПЦР.

ПЦР традиционно проводится в справочной лаборатории, которая обычно возвращает результаты в течение 24 часов после получения образца. Доставка образцов в референс-лаборатории может значительно увеличить задержку с получением результатов. LexaGene помогает решить проблему «времени», автоматизируя ПЦР в момент необходимости и возвращая результаты примерно через 1 час после начала обработки образца.

Подробнее о кПЦР читайте в блоге компании.

Основы тестирования на коронавирусную болезнь 2019

Español 简体 中文 한국어 Tagalog Việt

Вы, наверное, много слышали о тестировании на коронавирус (COVID-19).Если вы считаете, что заболели COVID-19 и нуждаетесь в тесте, немедленно обратитесь к своему врачу или в местный отдел здравоохранения. Вы также можете найти общественный центр тестирования в своем штате или купить домашний тест, разрешенный FDA. Некоторые домашние тесты, разрешенные FDA, дают результаты в течение нескольких минут. Другие требуют, чтобы вы отправили образец по почте в лабораторию для анализа.

Понимание тестирования на COVID-19 — ключ к принятию обоснованного решения, отвечающего вашим потребностям.

Типы тестов

Существуют разные типы тестов — диагностический тест и тест на антитела .

Диагностические тесты могут показать, есть ли у вас активная инфекция COVID-19 и вам нужно принять меры для карантина или изоляции от других. Молекулярные тесты и на антиген — это типы диагностических тестов, с помощью которых можно определить, есть ли у вас активная инфекция COVID-19. Образцы для диагностических тестов обычно собирают с помощью мазка из носа или горла или слюны, выплевывая в трубку.

Тесты на антитела ищут антитела в вашей иммунной системе, вырабатываемые в ответ на SARS-CoV-2, вирус, вызывающий COVID-19.Тесты на антитела не следует использовать для диагностики активной инфекции COVID-19 . Для выработки антител может потребоваться несколько дней или недель после заражения, и они могут оставаться в вашей крови в течение нескольких недель или более после выздоровления. Образцы для тестов на антитела обычно представляют собой кровь из пальца или кровь, взятую вашим врачом или другим медицинским персоналом.

Начало испытаний

Если вы прошли тестирование, вам следует изолировать себя дома до тех пор, пока вы не получите результаты теста и не будете следовать советам вашего поставщика медицинских услуг или специалиста в области общественного здравоохранения.

Когда мне следует пройти тест?

• Если у вас есть симптомы COVID-19, даже после вакцинации
• Если у вас был тесный контакт (в пределах 6 футов в общей сложности 15 минут или более) с кем-то с подтвержденным COVID-19, даже после вакцинации
• Если вы принимали участие в деятельности, которая подвергает вас повышенному риску заражения COVID-19 из-за того, что вы не могли дистанцироваться по мере необходимости, например, путешествуя, посещая большие общественные или массовые собрания или находясь в переполненных помещениях
• Если вас попросили или направили пройти тестирование вашим поставщиком медицинских услуг, местным или государственным отделом здравоохранения

В вашей школе, на рабочем месте или в вашем районе также может быть установлена ​​программа скрининга, в рамках которой они проверяют людей, входящих в группу (на работе, в школе), даже если нет оснований подозревать, что эти люди инфицированы COVID-19.FDA опубликовало дополнительную информацию о программах скрининга в этом информационном бюллетене.

Чтобы найти местный центр тестирования, вам следует обратиться к своему поставщику медицинских услуг или зайти на веб-сайт вашего штата или местного департамента здравоохранения.

Заказ теста

Многие тесты, в том числе некоторые домашние тесты и тесты на дому, требуют рецепта или заказа от поставщика медицинских услуг.

Тесты по рецепту — Поставщики медицинских услуг могут определить, нужен ли вам тест, и убедиться, что вы прошли наиболее подходящий тест и знаете, что означают результаты.Например, определенные тесты разрешены только для людей с подозрением на COVID-19 или для людей с симптомами COVID-19, которые начались в течение определенного количества дней. Поставщик медицинских услуг может помочь определить, какой тест лучше всего подходит для вашей ситуации. Домашний сбор только по рецепту и домашние тесты могут потребовать от вас ответа на некоторые вопросы в Интернете, чтобы поставщик медицинских услуг мог определить, назначить ли вам конкретный тест или заказать его.

Тесты без рецепта — Некоторые тесты доступны без рецепта.Домашние тесты и тесты на дому, доступные без рецепта, могут называться «напрямую к потребителю» (DTC) или «внебиржевыми» (OTC). Тесты DTC и OTC можно приобрести в аптеке или в Интернете, но они могут быть доступны не везде.

Домашнее собрание и домашние тесты

Могу ли я пройти тест на дому? В чем разница между домашним сбором и домашним тестом? Какой комплект мне нужно заказать? Чтобы ответить на эти вопросы, важно понимать различия в тестах на COVID-19 и домашних сборах по сравнению с домашними тестами.

Почему это важно? Эти различия определяют, где будет собираться образец, где проводится тест и насколько быстро вы узнаете результаты. Хотя домашние тесты могут быть самым быстрым и удобным вариантом, они могут не подходить для всех ситуаций.

Если вы хотите быть уверены, что приобретаемый вами тест одобрен FDA, посетите наши таблицы разрешений на использование в чрезвычайных ситуациях (EUA) по молекулярным, антигенам, серологии и адаптивному иммунному ответу.

Используя поле поиска в таблицах EUA, вы можете использовать ключевые слова для поиска и фильтрации типа теста или набора для сбора, который вы ищете. С помощью этого поиска, когда новые тесты разрешены для использования, потребители могут получить доступ к актуальной информации об авторизованных тестах и ​​наборах для сбора.

Типы образцов

Разрешается использовать разные тесты с разными типами образцов. Наиболее распространенные типы образцов:

Образцы тампона используйте тампон (аналогичный длинной ватной палочке) для взятия образца из носа или горла.Типы образцов включают:

• Передние ноздри (носовые) — образец взят непосредственно изнутри ноздрей
• Средняя носовая раковина — проба берется изнутри носа вверх
• Носоглотка — образец берется из глубины носа, достигая задней части глотки
• Ротоглотка — забор пробы из средней части глотки (глотки) сразу за ротовой полостью

Образцы слюны собирают путем сплевывания в пробирку, а не тампоном из носа или горла.

Образцы крови используются только для тестирования на антитела, а не для диагностики COVID-19. Образцы венозной крови обычно берут в кабинете врача или в клинике. Некоторые тесты на антитела используют кровь из пальца.

Тестирование объединенной выборки

Один из способов тестирования большего количества людей на COVID-19 для лабораторий — объединение образцов, полученных от нескольких человек, в один образец и их совместное тестирование, что также называется «объединением». Объединение наиболее полезно в тех областях, где ожидается, что большинство образцов будут отрицательными.Это экономит время и материалы для тестирования, когда ожидается лишь очень небольшое количество положительных результатов, что позволяет лабораториям тестировать больше образцов.

Если тест отрицательный или не обнаруживает SARS-CoV-2, то ни у одного из людей, чьи образцы были включены в объединенную выборку, скорее всего, нет активной инфекции COVID-19.

Если тест положительный, показывая наличие вируса, вызывающего COVID-19, каждый проходит повторное тестирование отдельно, либо путем взятия нового образца, либо тестирования оставшейся части исходного образца, чтобы найти положительные образцы.

Анализ результатов теста

Как правило, для диагностических тестов отрицательный результат означает, что тест не обнаружил вирус SARS-CoV-2, а положительный результат означает, что тест действительно обнаружил вирус SARS-CoV-2, и у вас очень высока вероятность заражения COVID-19. .

Однако ни один тест не идеален. Всегда есть шанс, что тест вернет ложный результат. Для диагностических тестов ложноотрицательный результат означает, что у вас нет COVID-19, но вы инфицированы, а ложноположительный результат означает, что у вас есть COVID-19, но вы не инфицированы.

Из-за этого, даже если вы получили отрицательный результат, вы должны продолжать практиковать профилактические меры, такие как дистанцирование, мытье рук и ношение масок, чтобы снизить риск распространения COVID-19.

Если вы заболели, вам следует оставаться дома и изолироваться от других, даже если вы получите отрицательный результат теста. Поговорите со своим лечащим врачом, чтобы определить, следует ли вам пройти повторное обследование или получить совет по лечению симптомов.

Для серологических тестов отрицательный результат означает, что тест не обнаружил антител к вирусу, вызывающему COVID-19.Положительный результат означает, что тест действительно обнаружил антитела к вирусу, вызывающему COVID-19, и возможно, что у вас была недавняя или предыдущая инфекция COVID-19, и у вас развился адаптивный иммунный ответ на вирус.

Мы не знаем, как долго антитела остаются в организме после заражения вирусом, вызывающим COVID-19. Мы не знаем, дают ли антитела вам защитный иммунитет против вируса, поэтому результаты серологического теста не следует использовать для определения наличия у вас иммунитета от вируса.FDA предостерегает пациентов от использования результатов любых серологических тестов в качестве указания на то, что они могут прекратить принимать меры для защиты себя и других, такие как прекращение социального дистанцирования или прекращение ношения масок.

Ключевые термины

• SARS-CoV-2 : вирус, вызывающий COVID-19
• COVID-19 : болезнь, вызванная вирусом SARS-CoV-2
• Тест домашней коллекции : образец собирается дома, но анализируется в лаборатории
• Тест напрямую к потребителю (DTC) : тесты для домашнего забора доступны без рецепта, но образец анализируется в лаборатории
• Тестирование на дому : потребитель завершает сбор образцов и тестирование дома
• Безрецептурный тест (OTC) : потребитель завершает сбор и тестирование образцов дома без рецепта
• Диагностический тест : показывает, есть ли у вас активная инфекция COVID-19
• Молекулярный тест : диагностический тест, выявляющий генетический материал вируса
• Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) : один тип молекулярного диагностического теста
• Тест амплификации нуклеиновой кислоты (NAAT) : один тип молекулярного диагностического теста
• Antigen Test : диагностический тест, выявляющий специфические белки вируса
• Тест на антитела (серология) : обнаруживает антитела, которые вырабатываются вашей иммунной системой в ответ на угрозу, такую ​​как определенный вирус; не используется для диагностики активной инфекции
• Тестирование объединенных образцов : совместное тестирование нескольких образцов

Сообщить о нежелательных явлениях

FDA рекомендует медицинским работникам и пациентам сообщать о нежелательных явлениях или побочных эффектах, а также о проблемах с производительностью, связанных с использованием тестов на COVID-19 или других медицинских продуктов, в Программу информации о безопасности и сообщении о нежелательных явлениях FDA MedWatch:

• Заполните и отправьте отчет онлайн через сайт MedWatch FDA.

  No related posts.