ГИАНЕБ раствор — инструкция по применению, цена, дозировки, аналоги, противопоказания, отзывы
Состав и форма выпуска препарата
Раствор для ингаляций гипертонический стерильный.
Вспомогательные вещества: дистиллированная вода.
5 мл — флаконы (1) — пачки картонные
Фармакологическое действие
Ингаляции раствора Гианеб ускоряют отхождение вязкого секрета (мокроты) в дыхательных путях благодаря осмотическому механизму. Высокая концентрация соли притягивает воду и способствует регидратации бронхиальной слизи.
Показания
Для ускорения отхождения мокроты при заболеваниях органов дыхания, особенно у пациентов с муковисцидозом и бронхоэктазами.
Новости по теме
Противопоказания
Повышенная чувствительность к компонентам препарата.
Дозировка
Препарат предназначен только для ингаляций.
Применяют по 1 флакону (5 мл) препарата 2 раза/сут или в соответствии с предписанием врача.
Лечение можно начать с меньшего количества препарата и увеличивать дозу постепенно.
Способ применения
Для ингаляции следует использовать раствор комнатной температуры.
Следует держать трубку небулайзера во рту и дышать в нормальном ритме на протяжении ингаляционной терапии, которая длится около 10 мин.
Можно использовать любой струйный небулайзер. Для получения оптимальных результатов рекомендуется использование струйного небулайзера компании PARI. Также можно использовать мембранные небулайзеры.
Если пациент использует небулайзер eFlow rapid, для оптимального распыления рекомендуется смачивать мембрану аэрозольного баллона перед каждым использованием. Чтобы смочить мембрану, следует просто окунуть ее в дистиллированную воду. Если прибор был только что использован, нет необходимости смачивать мембрану снова.
Особые указания
Первое использование препарата должно происходить под контролем врача или квалифицированного персонала.
Использование препарата детьми должно происходить под контролем взрослого.
Особенно чувствительным к препарату пациентам в начале лечения рекомендуется премедикация бронхолитическими средствами, которые помогают предотвратить бронхоспазматические реакции. Премедикацию бронхолитическими средствами проводят под контролем врача.
В случае приступа бронхоспазма или непрекращающегося кашля пациенту необходимо прервать лечение и сообщить об этом лечащему врачу.
Не следует применять препарат, если во время первого открытия флакона обнаруживается, что флакон был поврежден или неплотно закрыт.
Не следует использовать повторно оставшееся содержимое флакона.
Не следует смешивать гипертонический раствор с другими препаратами.
Влияние на способность к управлению транспортными средствами и механизмами
Маловерояно влияние раствора Гианеб на способность управлять транспортными средствами и заниматься другими потенциально опасными видами деятельности.
Описание препарата ГИАНЕБ основано на официально утвержденной инструкции по применению и утверждено компанией–производителем.
Предоставленная информация о ценах на препараты не является предложением о продаже или покупке товара. Информация предназначена исключительно для сравнения цен в стационарных аптеках, осуществляющих деятельность в соответствии со статьей 55 ФЗ «Об обращении лекарственных средств».
Обнаружили ошибку? Выделите ее и нажмите Ctrl+Enter.
Наблюдательное исследование по использованию комбинированного раствора 7% раствора натрия хлорида и 0,1% гиалуроновой кислоты у взрослых больных муковисцидозом Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»
Наблюдательное исследование по использованию комбинированного раствора 7% раствора натрия хлорида и 0,1% гиалуроновой кислоты
У ВЗРОСЛЫХ БОЛЬНЫХ МУКОВИСЦИДОЗОМ
С.
А. КРАСОВСКИЙ123, Е.Л. АМЕЛИНА1, А.В. ЧЕРНЯК1, Е.И. КОНДРАТЬЕВА3, Ю.В. ГОРИНОВА4, О.Г. ЗОНЕНКО5, Д.Ф. СЕРГИЕНКО6, А.Р. ТАТАРСКИЙ1
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт пульмонологии Федерального медико-биологического агентства»: 115682, г. Москва, Ореховый бульвар, д. 28
2 Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы «Городская клиническая больница имени Д.Д. Плетнёва Департамента здравоохранения города Москвы»: 105077, г. Москва, 11-Парковая улица, д. 32
3 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Медико-генетический научный центр»: 115478, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1
4 Федеральное государственное автономное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр здоровья детей» Министерства здравоохранения Российской Федерации: 119926 г.
5 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1
6 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Астраханский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации: 414000, г. Астрахань, Бакинская улица, д. 121
Информация об авторах: Красовский Станислав Александрович —
к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории муковисцидоза Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт пульмонологии Федерального медико-биологического агентства»; врач-пульмонолог 2 пульмонологического отделения Государственного бюджетного учреждения здравоохранения города Москвы «Городская клиническая больница имени Д.
Черняк Александр Владимирович — к.м.н., заведующий лабораторией функциональных и ультразвуковых методов исследования Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт пульмонологии Федерального медико-биологического агентства»; тел: +7 (495) 465-53-84; e-mail: [email protected] Кондратьева Елена Ивановна — профессор, д.м.н., руководитель научно-клинического отдела муковисцидоза Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Медико-генетический научный центр»; тел.
демика В.А. Таболина Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации; +7 (495) 936-93-74; e-mail: [email protected] Сергиенко Диана Фикретовна — д.м.н., профессор кафедры факультетской педиатрии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Астраханский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, e-mail: gazken@ rambler.
РЕЗЮМЕ
Проведено неинтервенционное проспективное когортное исследование среди взрослых больных муковисцидозом, получающих муколитическую терапию комбинированным препаратом 7% раствора №С1 и 0,1% гиалуроновой кислоты (ИМН Гианеб) и 7% раствором №С1 в течение 4 и 8 недель. Материалы и методы: в исследование включено 24 больных МВ старше 18 лет, проведен сравнительный анализ респираторной функции, удовлетворенности терапией, эффективности и безопасности лечения через 4 недели терапии в группах 7% р-ра (п = 12) и ИМН Гианеб (п = 12), а также динамика данных показателей на фоне применения ИМН Гианеб в течение 8 недель (п = 12).
Выводы: ИМН Гианеб в сравнении с 7% р-ром №С1 имеет лучшую переносимость у взрослых пациентов с муковисцидозом. Применение ИМН Гианеб снижает частоту и выраженность раздражения слизистой оболочки глотки, кашля и заложенности носа при применении в течение одного месяца.
Ключевые слова: муковисцидоз, гипертонический раствор, гиалуроновая кислота, муколитическая терапия
Для цитирования: Красовский С.А., Амелина Е.Л., Черняк А.В., Кондратьева Е.И., Горинова Ю.
В., Зоненко О.Г, Сергиенко Д.Ф., Татарский А.Р. Наблюдательное исследование по использованию комбинированного раствора 7% раствора натрия хлорида и 0,1% гиалуроновой кислоты у взрослых больных муковисцидозом. Медицинский совет. 2018; 21: 72-77. DOI: https://doi.org/10.21518/2079-701X-2018-21-72-77.
Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Observational study of the use of 7% sodium chloride solution combined with 0,1% hyaluronic acid
IN THERAPY OF ADULTS WITH CYSTIC FIBROSIS
Stanislav A. KRASOVSKY123, Elena L. AMELINA1, Alexandr V. CHERNYAK1, Elena I. KONDRATIEVA3, Julia V. GORINOVA4, Oksana G. ZONENKO5, Diana F. SERGIENKO6, Alexey R. TATARSKY1
1 Federal State Budgetary Institution «Research Institute for Pulmonology of the Federal Medical Biological Agency»: 28 Orekhovy Boulevard, Moscow, 115682
2 State Budgetary Institution of Healthcare of the city of Moscow «Pletnev City Clinical Hospital of the Department of Health of Moscow»: 32 11-Parkovaya, Moscow, 105077
3 Federal State Budgetary Research Institution «Medical Genetic Research Center»: 1 Moskvorechie, Moscow, 115478
4 Federal State Autonomous Institution «National Medical Research Center for Children’s Health» of the Ministry of Health of the Russian Federation: Bldg.
1, 2 Lomonosovsky Prospect, Moscow, 119926
5 Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education «Pirogov Russian National Research Medical University» of the Ministry of Health of Russia, 1 Ostrovityanova, Moscow, 117997
6 Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education «Astrakhan State Medical University» of the Ministry of Health of the Russian Federation: 121 Bakinskaya, Astrakhan, 414000
Author credentials:
Krasovsky Stanislav Alexandrovich — Cand. of Sci. (Med.), Senior Researcher, the Cystic Fibrosis Laboratory, the Federal State Budgetary Institution «Research Institute for Pulmonology of the Federal Medical Biological Agency»; a pulmonologyst, the 2nd Pulmonology Department of the State Budgetary Institution of Healthcare of the city of Moscow «Pletnev City Clinical Hospital of the Department of Health of Moscow»; Senior Researcher, the Research Clinical Cystic Fibrosis Department, the Federal State Budgetary Research Institution «Medical Genetic Research Center»; tel.
: +7(495) 965-23-24; e-mail: [email protected] Amelina Elena Lvovna — Cand. of Sci. (Med.), Deputy Head of the Cystic Fibrosis Laboratory, the Federal State Budgetary Institution «Research Institute for Pulmonology of the Federal Medical Biological Agency»; tel.: +7 (499) 780-08-06; e-mail: [email protected]
Chernyak Alexandr Vladimirovich — Cand. of Sci. (Med.), Deputy Head of the Cystic Fibrosis Laboratory, the Federal State Budgetary Institution «Research Institute for Pulmonology of the Federal Medical Biological Agency»; tel.: +7 (495) 465-53-84; e-mail: [email protected] Kondratieva Elena Ivanovna — Professor, Dr. of Sci. (Med.), Head of the Research Clinical Cystic Fibrosis Department, the Federal State Budgetary Research Institution «Medical Genetic Research Center»; tel.: +7(499) 137-01-97; e-mail: [email protected] Gorinova Julia Viktorovna — Cand. of Sci. (Med.), a pediatrician, the Cystic Fibrosis Department, Federal State Autonomous Institution «National Medical Research Center for Children’s Health» of the Ministry of Health of the Russian Federation; tel.
: +7 (499) 134-93-31; e-mail: [email protected]
Zonenko Oksana Grigorievna — Assistant Professor of Tabolin Hospital Pediatrics Department of Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education «Pirogov Russian National Research Medical University», the Ministry of Health of Russian Federation; tel.: +7 (495) 936-93-74; e-mail: [email protected] Sergienko Diana Fikretovna — Dr. of Sci. (Med.), Professor of the Department of Faculty Pediatrics, the Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education «Astrakhan State Medical University» of the Ministry of Health of the Russian Federation, e-mail: gazken@ rambler.ru, tel.: (8512) 524143. Tatarsky Alexey Romanovich — Dr. of Sci. (Med.), Professor, Head of the Educational Center of the Federal State Budgetary Institution «Research Institute of Pulmonology of the Federal Medical Biological Agency»; tel.: +7(916) 569-23-73; e-mail: [email protected]
ABSTRACT
A non-interventional prospective cohort study was conducted on adult patients with cystic fibrosis, who received mucolytic therapy with 7% NaCl solution combined with 0.
1% hyaluronic acid (medical product Hyaneb) and 7% NaCl solution for 4 and 8 weeks. Materials and methods: A total of 24 CF patients over 18 years old were enrolled in the study. A comparative analysis of respiratory function, therapy satisfaction, efficacy and safety of treatment was conducted following 4 weeks of therapy in 7% NaCl Solution Group (n = 12) and MP Hyaneb Group (n = 12), and the dynamics of these parameters was assessed against the background of the use of MP Hyaneb for 8 weeks (n = 12). Results: At week 4 of treatment, a significantly smaller number of patients complained of nasal congestion, ears and or accumulation of mucus in the throat and chest, irritation of the throat and unpleasant taste in the MP Hyaneb Group. No significant differences in the onset and increase in the intensity of cough were achieved. No significant differences between the groups in terms of spirometry parameters were identified.
Findings: MP Hyaneb showed the best tolerability compared to 7% NaCl solution in adult patients with cystic fibrosis.
The use of MP Hyaneb reduces the frequency and severity of irritation of the pharyngeal mucosa, cough and nasal congestion following administration for one month.
Keywords: cystic fibrosis, hypertonic solution, hyaluronic acid, mucolytic therapy
For citing: Krasovsky S.A., Amelina E.L., Chernyak A.V., Kondratieva E.I., Gorinova Yu.V., Zonenko O.G., Sergienko D.F., Tatarsky A.R. Observational study of the use of 7% sodium chloride solution combined with 0.1% hyaluronic acid in therapy of adults with cystic fibrosis. Meditsinsky Sovet. 2018; 21: 72-77. DOI: https://doi.org/10.21518/2079-701X-2018-21-72-77.
Conflict of interest: The authors declare no conflict of interest.
ВВЕДЕНИЕ
Муковисцидоз (МВ) — тяжелая наследственная экзо-кринопатия, существенно снижающая продолжительность и качество жизни пациентов.
Ведущим в патогенезе является бронхолегочное поражение, что определяется существованием порочного круга: генетически обусловленная дисфункция ионных каналов приводит к нарушению нормальной гидратации бронхиального секрета, что вызывает ретенцию патогенной микрофлоры и формирование активного нейтрофильного воспаления. В итоге прогрессирующая бронхиальная обструкция является замыкающим фактором в порочном круге, которая создает дальнейшие условия для поддержания и усиления воспаления [1, 2].
Большинство терапевтических стратегий лечения МВ созданы для разрушения этого порочного круга. Так, на коррекцию генетического дефекта направлена развивающаяся таргетная патогенетическая терапия, против патогенной микрофлоры разработаны антибактериальные стратегии, включая ингаляционную антибактериальную терапию, определенную нишу занимает противовоспалительное лечение: нестероидные противовоспалительные препараты, макролиды в субингибирующих дозах и глюкокортикостероиды [1, 2].
Существенным компонентном в лечении МВ являются мероприятия, направленные на улучшение эвакуации гнойной мокроты из респираторного тракта. Это кинезите-рапия совместно с медикаментозным улучшением реологических свойств мокроты. Поиск эффективной и хорошо переносимой отхаркивающей терапии беспокоит длительное время специалистов, занимающихся МВ. Традиционно применяемые широко с 70-х годов ХХ века N-ацетилцистеин и амброксол в настоящее время имеют низкую доказательную базу и применяются у больных МВ все реже и реже [1, 2]. Приоритет в назначении гиперосмо-лярных растворов у детей, страдающих МВ, можно отдать отечественному пульмонологу Рачинскому С.В., который в актовой речи о современных проблемах пульмонологии детского возраста выделил ингаляции 2% раствора соды с 3% раствором поваренной соли как успешно применяемую муколитическую терапию (1970) [3]. Доказательная база, демонстрирующая улучшение функции легких и снижение частоты обострений, а также безопасность при ингаляциях солевого раствора сформировалась в результате ряда контролируемых исследований [4-9].
В настоящее время 7% р-р NaCL рекомендован как постоянная ингаляционная отхаркивающая терапия для пациентов с МВ [2, 10]. В России, по данным национального регистра, в 2016 г. его использовали 54,5% больных, по данным европейского регистра 2016 г., частота применения данной терапии составила в Германии и Израиле 75,7% и 70,1% соответственно [11, 12]. Однако некоторым известным ограничением постоянного лечения 7% р-ра NaCL является развитие побочных эффектов, связанных с раздражающем действием соли, таких как увеличение кашля и бронхоспазм, а также ощущение неприятного соленого вкуса раствора. Очевидно, эти побочные эффек-
ты могут определять отказ от терапии или неполную приверженность к ней. Определенное решение проблемы плохой переносимости было найдено добавлением к 7% р-ру NaCL гиалуроновой кислоты — гликозамингликана, отвечающего за водный гомеостаз во внеклеточном матриксе.
В различных in vitro и in vivo исследованиях были описаны смягчающие эффекты гиалуроновой кислоты за счет улучшения гидратации и уменьшения раздражения дыхательных путей [13-15]. В нескольких контролируемых исследованиях также было показано, что добавление 0,1% раствора гиалуроновой кислоты к 7% р-ру NaCL переносилось лучше, чем 7% р-р NaCL отдельно [16-19].
7% р-р NaCL в комбинации с 0,1% раствором гиалуроновой кислоты (Гианеб®, Кьези Фармацевтичи, Италия) был зарегистрирован в России в декабре 2015 г. Целью данного наблюдательного исследования являлась оценка приверженности лечению и удовлетворенности взрослых больных муковисцидозом изделием медицинского назначения (ИМН) Гианеб в сравнении с 7% р-ром NaCL.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследование проводилось у 24 больных МВ в возрасте старше 18 лет, получающих муколитическую терапию комбинированным препаратом 7% p-p NaCL и 0,1% гиалуроновой кислоты (ИМН Гианеб®, Кьези Фармацевтичи, Италия) или 7% p-p NaCL.
Исследование являлось неинтервенционным, проспективным и когортным и проводилось с июля 2016 г. по февраль 2017 г. на базе ФГБУ НИИ пульмонологии ФМБА России. Критерии включения в исследование:
■ Подтвержденный диагноз МВ (дважды положительный потовый тест и/или выявление двух мутаций в гене МВ)
■ Согласие участвовать в исследовании
■ Способность выполнять процедуры исследования и продолжать базисную терапию
■ Объем форсированного выдоха за 1 секунду (ОФВг) 40-90% от должного
■ Клинически стабильное состояние, определяющееся отсутствием данных за обострение бронхолегочного процесса: нарастание частоты и продуктивности кашля, повышение температуры тела, снижение легочной функции (ОФВг) на 10 и более процентов по сравнению с лучшими предыдущими данными на протяжении года.
■ Назначение дорназы альфа и/или ингаляционных антибиотиков и изменение какого-либо компонента базисной терапии не менее чем за месяц до первого визита исследования.
Критерии исключения из исследования:
■ Тяжелое течение заболевания: ОФВг < 40% должного и/ или включение в лист ожидания на трансплантацию легких
■ Пациенты, имеющие следующие состояния: эпизод кровохарканья/легочного кровотечения за последние три месяца, инфаркт миокарда или нарушение церебрального кровообращения в прошлом, радикальное оперативное лечение или диагностированная аневризма сосудов головного мозга, аорты в течение последних трех месяцев.
■ Обострение бронхолегочного процесса (см. выше критерии включения)
■ Хроническое инфицирование дыхательных путей Burkholderia cepacia complex
■ Планируемый плановый курс внутривенной антибактериальной терапии
■ Ранее выявленная непереносимость гипертонического раствора NaCl
ОРГАНИЗАЦИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследование длилось 8 недель.
Были сформированы две группы пациентов. Группа №1. Пациенты (n = 12) в этой группе первые четыре недели исследования ингали-ровали 7% р-р NaCl, а следующие 4 недели — ИМН Гианеб. Группа №2. Пациенты (n = 12) в этой группе 8 недель ингалировали ИМН Гианеб. 7% p-p NaCl назначался по клиническим стандартам: ингаляции по 4,5 мл 2 раза в день. ИМН Гианеб пациенты ингалировали согласно инструкции по применению: по 5 мл 2 раза в день. Пациенты продолжали получать базисную терапию. Очные визиты к врачу были в начале исследования, через 4 и 8 недель лечения, в ходе которых оценивались функция внешнего дыхания (ОФВ1, ФЖЕЛ), насыщение гемоглобина кислородом (SpO2), проводилось физикальное обследование больного, пациентами заполнялась визуально-аналоговая шкала (ВАШ) о трудности отхождения мокроты, а также опросник удовлетворенности препаратом исследования. Визуально-аналоговая шкала включала вопросы о переносимости и эффективности терапии, где значение «0» определялось как «очень трудно», «10» — «очень легко».
NaCl (n = 12) и ИМН Гианеб (n = 12) соответственно) и оценена динамика показателей удовлетворенности терапией, эффективности и безопасности лечения в группе 2 (ингаляции ИМН Гианеб в течение 8 недель (n = 12)).
СТАТИСТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Для обработки данных использовали методы описательной статистики. Сравнение производилось с применением U-критерия Манна — Уитни, критерия Вилкоксона, критерия Single test. Уровень достоверности считали значимым при p<0,05. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение и/или медиана (интерк-вартильный размах).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Общая характеристика. В исследование были включены 24 взрослых пациента МВ (13 мужчин), в возрасте от 19 до 49 лет, средний возраст 26,2 ± 7,2, медиана возрас-
та 24,0 (9,0) года. Средние показатели в общем по группе составили: рост 168 ± 8,2 см, масса тела 54,3 ± 8,2, индекс массы тела (ИМТ) 19,2 ± 1,9кг/м2, возраст установления диагноза: 9,3 ± 11,1 лет, потовый тест при установлении диагноза: 97,1 ± 29,5 ммоль/л, ОФВг 60,0 ± 14,6% от должного, форсированная жизненная емкость легких (ФЖЕЛ): 86,7 ± 12,5% от должного, SpO2 96 ± 1,0 (медиана 96 (1,0)%). В генетическом статусе доминировали «тяжелые» генотипы (75%), панкреатическая недостаточность развилась у 83,3%. Cопутствующая патология распределилась следующим образом: полипозный риносинусит -12 пациентов (50%), аллергический бронхолегочный аспергиллез — 1 больной, сахарный диабет — 1 пациент, клинически значимого поражения печени, пневмоторакса в анамнезе, легочного кровотечения/кровохарканья и интестинальной обструкции в данной выборке отмечено не было. В структуре микробиологического профиля респираторного тракта доминирующим патогеном являлась Pseudomonas aeruginosa, которая выявлялась у 12 (50%) больных, Staphylococcus aureus определялся у 10 пациентов (41,7%), среди которых 5 больных были инфицированы MRSA (20,8%), инфицирование Achromobactersp. отмечено у 6 (25,0%), а Escherichia coli у одного пациента. Большинство микроорганизмов находились в микст-инфицировании. Сравнительная характеристика групп 1 и 2 представлена в таблице 1. Достоверных различий между группами не выявлено.
РЕЗУЛЬТАТЫ ЛЕЧЕНИЯ
Все пациенты закончили терапию. В ходе лечения ни у одного участника не развилось каких-либо событий, приведших к преждевременному завершению исследования, таких как обострение бронхолегочного процесса и/или очевидная непереносимость препарата.
Сравнение показателей спирометрии и кислородного статуса между группами на 4 и 8 неделях терапии представлены в таблице 2.
Не отмечено достоверной разницы между группами на 4-й недели терапии. Также не отмечено достоверной разницы между показателями спирометрии и кислородного статуса внутри группы между визитами 1 и 2.
Показатели функции внешнего дыхания и кислородного статуса в группе №2 на 8-й неделе лечения (визит 2) составили: ОФВг 62,2 ± 15,2 (63,0 (22,0)) % от должного, ФЖЕЛ: 90,1 ± 12,5 (92,0 (18,0)) % от должного, SpO2 96 (2,0)%. Не выявлено достоверной разницы по показателям спирометрии и кислородного статуса в группе 2 между визитами 1 и 2, 2 и 3, 1 и 3.
РЕЗУЛЬТАТЫ АНКЕТИРОВАНИЯ
По опросникам о проявлении заболевания, которые заполнялись на первом визите, через 4 и 8 недель терапии, статистически достоверные различия получены через 4 недели лечения при сравнении показателей между группами лечения. На 1 визите (через 4 недели терапии) в группе №1 — 66,7% больных МВ отмечали в
Таблица 1. Общая характеристика больных в группах 1 и 2 Table 1. General characteristics of patients in groups 1 and 2
Показатель Группа №1 (n = 12) Группа №2 (n = 12) p
Возраст, годы 24,7 ± 5,4 23,5 (8,5) 27,8 ± 8,5 24,0 (10,5) NS
Возраст установления диагноза, годы 6,9 ± 9,5 2,6 (8,9) 11,6 ± 12,4 9,6 (16,8) NS
Пол, м/ж 7/5 6/6 NS
«Тяжелый» генотип, n (%) 10 (83,3) 8 (66,7) NS
«Мягкий» генотип, n (%) 2 (16,7) 4 (33,3) NS
Панкреатическая недостаточность, n (%) 11 (91,7) 9 (75,0)
ИМТ, кг/м2 18,9 ± 1,7 19,3 (2,9) 19,5 ± 2,1 18,8 (3,0) NS
ФЖЕЛ, % должн. 85,5 ± 12,7 85,0 (16,3) 88,0 ± 12,6 91,2 (17,3) NS
ОФВ1, % должн. 61,2 ± 16,3 66,4 (23,3) 58,6 ± 13,2 60,9 (26,0) NS
SpO2, % 96 (1,5) 96 (2,0) NS
P. aeruginosa, n (%) 7 (58,3) 5 (41,7) NS
S. aureus, n (%) 6 (50,0) 4 (33,3) NS
MRSA, n (%) 2 (16,7) 3 (25,0) NS
Achromobacter sp., n (%) 3 (25,0) 3 (25,0) NS
E. coli, n (%) 1 (8,3) — NS
Полипозный риносинусит, n (%) 5 (41,7) 7 (58,3) NS
Аллергический бронхолегочный аспергиллез, n (%) — 1 (8,3) NS
Сахарный диабет, n (%) 1 (8,3) — NS
NS — p>0,05.
течение последних двух недель до визита заложенность носа, ушей и/или скопление слизи в горле, грудной клетке и т.п., в то время как в группе №2 только в 25,0% случаев наблюдались данные изменения (р = 0,04).
По опроснику удовлетворенности препаратом отмечалась достоверная разница между группами лечения по таким симптомам, как раздражение горла — 83,3% в группе №1 и 41,7% в группе №2 (р = 0,03), неприятный вкус -75,0% в группе №1 и 16,7% в группе №2 (р = 0,04). По следующим показателям: возникновение и увеличение интенсивности кашля, а также изменение равновесия достоверных различий между группами №1 и №2 не выявлено: 75,0% и 50,0%, 8,3% и 16,7% соответственно.
При этом при продолжении лечения препаратом Гианеб в группе №2 на 8-й неделе терапии отмечалась некоторая тенденция к снижению количества симптомов, отмеченных на 4-й неделе лечения. Так, доля пациентов, указавших на раздражение горла и возникновение и увеличение интенсивности кашля, снизилась с 50,0% до 33,3%.
При заполнении пациентами визуально-аналоговой шкалы с вопросом «Насколько было трудно откашливать мокроту на прошлой неделе?», где значение «0» определялось как «очень трудно», «10» — «очень легко», не было продемонстрировано достоверных различий. Так, через 4 недели терапии по оценке визуально-аналоговой шкалы в группе №1 медиана показателя составила 4,0 (2,0), а в группе №2 — 5,0 (2,0). Также не было продемонстрировано различий в вопросе о приемлемости терапии: некоторые «трудности в лечении» испытывали 41,7% пациентов в группе №1 и 25,0% в группе №2.
ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты проведенного наблюдательного исследования эффективности и переносимости муколитической терапии 7% р-ра NaCL и ИМН Гианеб среди взрослых пациентов с МВ продемонстрировали, что ИМН Гианеб имеет лучшую переносимость по сравнению с 7% р-ра NaCL: выявлена достоверная разница по таким показателям, как раздражение горла и неприятный вкус препарата. Также была отмечена некоторая тенденция к снижению выраженности симптомов при дальнейшем применении ИМН Гианеб.
Данные, полученные в нашем наблюдательном исследовании, корреспондируют с данными предыдущих рандомизированных контролируемых исследований, в которых было показано улучшение переносимости 7% р-ра NaCL при добавлении к нему 0,1% гиалуроновой кислоты [16-19]. В этих исследованиях у пациентов с МВ реже отмечалось развитие таких симптомов, как кашель, раздражение горла, соленый привкус, а также лучшая переносимость терапии, по мнению пациентов, в группе лечения комбинированным препаратом 7% р-ра NaCL и 0,1% гиалуроновой кислоты по сравнению с применением только 7% р-р NaCL. В одном из исследований из 21 пациента с МВ и непереносимостью лечения 7% р-ра NaCL 17
• Таблица 2. Показатели функции внешнего дыхания в группах 1 и 2 исходно и через 4 недели лечения
• Table 2. Indicators of respiratory function in groups 1 and 2 initially and after 4 weeks of treatment
Визит Показатели ФВД Группа № 1 Группа № 2 р
ОФВ1, % должн. 61,2 ± 16,3 66,4 (23,3) 58,6 ± 13,2 60,9 (26,0) NS
Визит 1 ФЖЕЛ, % должн. 85,5 ± 12,7 85,0 (16,3) 88,0 ± 12,6 91,2 (17,3) NS
SpO2, % 96 (1,5) 96 (2,0) NS
Визит 2 (через 4 недели терапии) ОФВ1, % должн. 63,0 ± 15,9 67,0 (24,0) 61,8 ± 14,6 62,0 (24,0) NS
ФЖЕЛ, % должн. 87,8 ± 13,9 88,0 (17,0) 89,2 ± 12,4 92,0 (17,0) NS
SpO2, % 96 (2,0) 96 (2,0) NS
NS — p>0,05.
пациентов, перешедших на терапию ИМН Гианеб, смогли продолжать лечение и переносили его хорошо [18]. Вне рамок этой работы любопытным является обнаруженный нами факт очевидного протективного действия гиалуро-новой кислоты в отношении снижения непереносимости ингаляций других растворов. Под нашим наблюдением были два пациента с непереносимостью тобрамицина (развитие бронхоспазма и сухого кашля), когда включение в терапию дважды в день ингаляций ИМН Гианеб привело к регрессу побочных реакций и позволило возобновить ингаляции тобрамицина [19].
В нашем исследовании ни в оной из групп не было достигнуто достоверное увеличение показателей спирометрии, что мы можем связать с малочисленностью групп, а также с возрастной особенностью выборки. Во взрос-
лом возрасте доминирует бронхиальная обструкция, обусловленная нарастающими с годами структурными изменениями легких. Именно фиксированный характер обструкции на фоне непродолжительного лечения (4-8 недель), возможно, повлиял на результат исследования.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, можно заключить, что ИМН Гианеб обладает лучшей переносимостью и такой же эффективностью по сравнению с 7% р-ром ЫаС1, что может позволить пациентам с МВ получать эффективную муколитиче-скую терапию с лучшей приверженностью к лечению, тем самым улучшая долгосрочный прогноз продолжительности и качества жизни пациентов МВ. ф
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Муковисцидоз. Монография под ред. Капранова Н.И., Каширской Н.Ю. M.: ИД «Медпрактика», 2014, 672с [Cystic fibrosis. Monograph under the editorship of Kapranova N.I., Kashirskaya N.Yu. M.: Medpraktika Publishing House, 2014, 672p.] (In Russ).
2. Национальный консенсус «Муковисцидоз: определение, диагностические критерии, терапия» Под ред. Кондратьевой Е.И., Каширской Н.Ю., Капранова Н.И., М.: ООО «Компания БОРГЕС», 2016. [National Consensus «Cystic fibrosis: definition, diagnostic criteria, therapy» Under the editorship of Kondrati-eva E.I., Kashirskaya N.Yu., Kapranova N.I., Moscow: Company BORGES LLC, 2016.] (In Russ).
3. Рачинский С.В. Актовая речь. Современные проблемы пульмонологии детского возраста. М. 1970. Типография метроснаба. 23 c. [Rachinsky S.V. Commencement address. Modern problems of children’s pulmonology. M. 1970. Metrosnab Typography. 23 p.] (In Russ).
4. Tarran R., Grubb B.R., Parsons D., et al. The CF salt controversy: in vivo observations and therapeutic approaches. MolCell. 2001;8:149-158.
5. Robinson M., Regnis J.A., Bailey D.L., King M., Bautovich GJ., Bye P.T. Effect of hypertonic saline, amiloride, and cough on mucociliary clearance in patients with cystic fibrosis. Am J RespirCritCareMed. 1996;153:1503-1509.
6. Robinson M., Hemming AL, Regnis JA, et al. Effect of increasing doses of hypertonic saline on mucociliary clearance in patients with cystic fibrosis. Thorax. 1997;52:900-903.
7. Donaldson S.H., Bennett W.D., Zeman K.L., Knowles M.R., Tarran R., and Boucher R.C. Mucus clearance and lung function in cystic
fibrosis with hypertonic saline. N Engl J Med. 2006;354:241-250.
8. Ballmann M., von der Hardt H. Hypertonic saline and recombinant human DNase: a randomised cross-over pilot study in patients with cystic fibrosis. J CystFibros. 2002;1:35-37.
9. Elkins M.R., Robinson M., Rose B.R., Harbour C., Moriarty C.P., Marks G.B., Belousova E.G., Xuan W., Bye P.T.; National Hypertonic Saline in Cystic Fibrosis (NHSCF) Study Group: A controlled trial of long-term inhaled hypertonic saline in patients with cystic fibrosis. N Engl J Med. 2006; 354:229-240.
10. Smyth A.R. et al. European cystic fibrosis society standards of care: Best practice guidelines. J. Cyst. Fibros. European Cystic Fibrosis Society. 2014; 13(S1): S23-S42.
11. Регистр больных муковисцидозом в Российской Федерации, 2016 год. Под редакцией С.А. Красовского, А.В. Черняка, А.Ю. Воронковой, Е.Л. Амелиной, Н.Ю. Каширской, Е.И. Кондратьевой, Т.Е. Гембицкой. М.: ИД «МЕДПРАКТИКА-М», 2018. 64 с. [The Russian Federation Cystic Fibrosis Patient Registry 2016. Under the editorship of Krasovsky S.A., Chernyak A.V., Voronkova A.Yu., Amelina E.L., Kashirskaya N.Yu., Kondratieva E.I., Gembitskaya T.E.. M.: MEDPRAKTIKA-M PH, 2018. 64 p.] (In Russ).
12. ECFS patient registry. Available at: https:// www.ecfs.eu/projects/ecfs-patient-registry/ intro(accessed date: 19.09.2018).
13. Cantor J.O., Shteyngart B., Cerreta J.M., Liu M., Armand G., and Turino G.M. The effect of hyalu-ronan on elastic fiber injury in vitro and elastase-induced airspace enlargement in vivo. ProcSocExpBiol Med. 2000;225:65-71.
14. Akatsuka M., Yamamoto Y., Tobetto K., Yasui T., and Ando T. Suppressive effects of hyaluronic acid on elastase release from rat peritoneal leucocytes. J Pharm Pharmacol. 1993;45:110-114.
15. Zahm J.M., Miliot M., Bresin A., Coraux C., and Birembaut P. The effect of hyaluronan on airway mucus transport and airway epithelial barrier integrity: potential application to the cyto-protection of airway tissue. Matrix Biol. 2011;30(7-8):389-395.
16. Buonpensiero P. et al. Hyaluronic acid improves «pleasantness» and tolerability of nebulized hypertonic saline in a cohort of patients with cystic fibrosis. Adv. Ther. 2010; 27(11): 870-878.
17. Ros M. et al. Hyaluronic Acid Improves the Tolerability of Hypertonic Saline in the Chronic Treatment of Cystic Fibrosis Patients: A Multicenter, Randomized, Controlled Clinical Trial. J. Aerosol Med. Pulm. Drug Deliv. 2014; 27(2): 133-137.
18. Carro L.M. et al. Tolerance of two inhaled hypertonic saline solutions in patients with cystic fibrosis. Med. Clin. (Bare). 2012; 138(2): 57-59.
19. Furnari M.L. et al. Nebulized hypertonic saline containing hyaluronic acid improves tolerabili-ty in patients with cystic fibrosis and lung disease compared with nebulized hypertonic saline alone: A prospective, randomized, double blind, controlled study. Ther. Adv. Respir. Dis. 2012; 6(6): 315-322.
20. Красовский С.А. Гианеб снижает непереносимость ингаляционного тобрамицина. XXVII Национальный конгресс по болезням органов дыхания, 2017. Сборник трудов. С. 90. [Krasovsky S.A. Hyaneb to reduce intolerance to inhaled tobramycin. The 27th National Respiratory Diseases Congress, 2017. Collected papers. P 90.] (In Russ).
HYANEB SOLUZIONE IPERTONICA DA NEBULIZZARE 30 FIALE 5 ML
Медицинское устройство CE.
Soluzione ipertonica da nebulizzare sodio cloruro 7% acido ialuronico 0,1%.
La nebulizzazione di Hyaneb facilita la mobilizzazione delle secrezioni viscose nelle vie aeree grazie ad un meccanismo osmotico. L’alta percentuale di sali richiama acqua e facilita l’idratazione del muco. Hyaneb è particolarmente indicato nei pazienti affetti da fibrosi cistica e in pazienti con Bronchiectasie.
Способ использования
Utilizzare una fiala da 5 ml due volte al giorno o secondo prescrizione medica. È possibile cominciare anche con un volume inferiore e salire progressivamente. Non utilizzare il contenuto residuo della fiala. Non mescolare alla soluzione ipertonica nessun altro medicinale.
Per un’ottimale nebulizzazione si consiglia di utilizzare nebulizzatore a vibrazione eFlow rapid. In alternativa si consiglia un nebulizzatore Pari LC Plus collegato ad un compressore Pari Boy e Pari turbo Boy. L’ampolla va tenuta in bocca, il paziente deve respirare regolarmente, la durata della seduta di aerosolterapia è di circa 10 minuti. Temperatura di utilizzo: nebulizzare la soluzione a temperatura ambiente.
Предупреждения
Il prodotto è solo per uso inalatorio. Il primo utilizzo del prodotto deve avvenire sotto controllo medico o di personale qualificato. L’utilizzo da parte dei bambini deve avvenire sotto la supervisione di un adulto. In soggetti particolarmente sensibili è consigliabile la premedicazione con broncodilatatori che possono aiutare a prevenire reazioni di broncospasmo specie all’inizio del trattamento. La premedicazione con broncodilatatori deve avvenire sotto controllo medico. In caso di comparsa di broncospasmo o tosse persistente interrompere il trattamento e informare il medico curante. Non utilizzare il prodotto qualora il contenitore fosse, al momento della prima apertura, danneggiato o non perfettamente chiuso. Non utilizzare il prodotto dopo la data di scadenza indicata sulla confezione.
Controindicato in pazienti con ipersensibilità nota ai componenti.
сохранение
Хранить при комнатной температуре.
компоненты
Cloruro di sodio 70 mg/ml; ialuronato sodico 1 mg/ml; acqua distillata.
формат
Confezione da 30 fiale da 5 ml sterili.
Cod. M0001
Chiesi Pharmaceuticals GmbH
Chiesi Farmacêutica Ltda
Chiesi Pharmaceutical (Shanghai) Co., ООО
Chiesi Hellas Pharmaceuticals S.А.
Chiesi Mexico S.A. de C.V.
Chiesi Pharmaceuticals (Pvt) Limited
Chiesi Pharmaceuticals LLC
Chiesi Pharmaceuticals B.V.
Chiesi İlaçTicaret Limited Sirketi A.Ş.
Проспективное рандомизированное двойное слепое контролируемое исследование
Терапевтические достижения в лечении респираторных заболеваний 6 (6)
316 http: // tar.sagepub.com
клиренс слизи инициирует и обостряет CF
заболевание легких, приводящее к неспособности эффективно предотвратить или искоренить бактериальную инфекцию,
обычно преобладает Pseudomonas aeruginosa
[Matsui et al. 1998], и последующее повреждение
легочной ткани.
Основываясь на вышеприведенной гипотезе, методы лечения, при которых
увеличивают объем жидкости на поверхности дыхательных путей и
, следовательно, очищают от слизи, должны облегчить легкое
у пациентов с МВ.Ингаляция гипертонического солевого раствора (HS;
NaCl 7%) была предложена в качестве лекарственного средства для увеличения гидратации жидкости на поверхности дыхательных путей у пациентов с МВ, тем самым улучшая мукоцилиарный клиренс на
[Turino and Cantor, 2003].
Кратковременное введение 7% HS, как сообщается,
улучшает реологические свойства и транспорт-
желчи мокроты, гидратацию дыхательных путей
лицо, мукоцилиарный клиренс и легочную функцию
и снижает количество обострений
иулучшают качество жизни больных МВ.
В 48-недельном рандомизированном долгосрочном двойном слепом исследовании
группа HS показала улучшение функции легких уже через 4 недели после рандомизации
с плато через 12 недель, что
сохранялось до конца исследования, поддерживая разницу в
с контрольной группой [Elkins et al.
2006]. Испытание также продемонстрировало другие важные преимущества использования HS в качестве рутинной терапии: число и продолжительность обострений легких
были значительно ниже, а процент
пациентов, оставшихся без обострения, был sig-
значительно выше с HS.Другими значительными преимуществами
были сокращение использования антибиотиков при
обострениях и улучшение посещаемости школы,
работы и всех обычных занятий [Elkins et al. 2006].
Однако заметное сужение дыхательных путей сообщается у
некоторых пациентов с МВ после ингаляции HS и
, это следует учитывать всякий раз, когда используется распыление HS
[Ratjen, 2006]. В таких случаях перед введением
HS необходимо ввести ходилататор bron-
, чтобы предотвратить сужение дыхательных путей.Тем не менее,
, даже когда бронходилататор используется в качестве премедикации, некоторые пациенты с МВ описывают нарушение дыхательных путей
греблей и другие побочные реакции, такие как кашель, стеснение в груди
и фарингит с HS. Соль —
раствора ГВ неприятна примерно
пациентам. Все эти нежелательные явления могут снизить приверженность лечению
.
Уникальным свойством гиалуроновой кислоты (ГК) является ее
водоудерживающих свойств, а содержание воды в ткани
зависит от количества содержащейся в ней гиалуроновой кислоты
[Turino and Cantor, 2003].Вдыхаемый HA
, по-видимому, предотвращает сужение бронхов и защищает от вызванного медиатором воспаления
бронхоспазма [Scuri and Abraham, 2003;
Петриньи и Аллегра, 2006]. Было также показано, что
смягчает действие человеческой нейтро-
фил эластазы и металлической макрофаги
ластазы человека на животных моделях эмфиземы легких
[Turino and Cantor, 2003; Скури и Авраам,
2003; Петриньи, Аллегра, 2006].Было показано, что у пациентов с
эмфиземой наблюдается значительное снижение HA на
[Schmid et al. 1982].
Следовательно, чтобы уменьшить побочные эффекты и избежать
или минимизировать плохое соблюдение режима терапии HS, был введен новый состав
, содержащий 7% NaCl и 0,1%
HA (Hyaneb, Eupharma srl, Болонья, Италия)
. недавно предложил. Вышеупомянутые свойства
ГК поддерживают его использование при заболеваниях легких.
Постулируется, что гидратационные свойства
вдыхаемой ГК увеличивают объем жидкости в дыхательных путях
поверхностной жидкости, что приводит к гидратации слизистой,
увеличивает слизистый транспорт и менее слизистый
закупоривает дыхательные пути.Кроме того, постулируется, что присутствие HA улучшит приятность
и переносимость распыленного HS
[Buonpensiero et al. 2010].
Основными целями нашего исследования были оценка
переносимости исследуемых продуктов и их эффективности
при бронхоспазме, измеренная по количеству
используемых агонистов β2 и измерению
объема форсированного выдоха за 1 с. (ОФВ1) до
и после вдыхания каждого продукта.Вторые цели
включали оценку толерантной способности двух продуктов на дыхательных путях (например,
частота кашля, жжения в горле
, соленого вкуса и угнетения грудной клетки) и
оценка эффективности лечения
легочной функции.
Дизайн исследования
Это было одноцентровое проспективное рандомизированное
двойное слепое контролируемое исследование с параллельными группами
нового состава HS, содержащего 7% NaCl и
0.1% HA по сравнению со стандартным HS, содержащим NaCl
7%. Исследование было одобрено местным регулирующим органом и комитетом по этике и проводилось в соответствии с Декларацией
Хельсинки и поправками к ней. Письменное информированное согласие
было получено от пациентов, родителей или законных представителей
до включения пациентов в исследование
. Исследование проводилось в Региональном справочном центре
по муковисцидозу в
Палермо, Италия.
Отчет о клиническом случае: вдыхание гипертонического раствора + гиалуроновая кислота при муковисцидозе с астматическими симптомами: новый терапевтический шанс
BMJ Case Rep. 2013; 2013: bcr2013009042.
История болезни
Центр кистозного фиброза, педиатрическое отделение, IRCCS G. Gaslini, Genova, Италия
Эта статья цитируется в других статьях в PMC.Abstract
Целью статьи является описание случая мальчика, страдающего муковисцидозом, с повторяющимся хрипом, не связанным с АБЛА, и частым обострением легких в детстве, который вдыхал 7% NaCl + 0.1% гиалуроновая кислота (ГК) в качестве поддерживающей терапии. Мы изучили базу данных пациентов и, проанализировав 7-летнее наблюдение, рассмотрели легочные обострения, курсы антибиотиков и стероидов, легочную функцию (объем форсированного выдоха за одну секунду; FEV -1 ) и микробиологические данные. После начала лечения 7% NaCl + 0,1% ГК мы наблюдали резкое снижение потребности в пероральных антибиотиках (0,55 курсов в месяц в период до лечения по сравнению с 0,10 курсов в месяц в период лечения), связанное с хорошим начальным восстановлением и стабильностью ОФВ 1 .По нашему мнению, этот случай может указывать на расширенное показание к применению ингаляционного 7% NaCl + 0,1% HA при МВ не только для пациентов, которые не переносили гипертонический раствор, но также и для пациентов с сопутствующими астматическими симптомами.
Предпосылки
Муковисцидоз (CF) — это генетическое заболевание, вызванное дефектным белком, транспортирующим хлорид-ионы, регулятором трансмембранной проводимости CF (CFTR), который вызывает образование густых выделений слизи, особенно в легких. 1 Мутации CFTR приводят к снижению поверхностной жидкости в дыхательных путях (ASL) и дефициту мукоцилиарного клиренса. 2 Многие исследования продемонстрировали, что ингаляционный гипертонический раствор (HS) улучшает функцию легких при CF, 3 4 ускоряя мукоцилиарный клиренс и увеличивая ASL. Кашель, бронхоспазм и раздражение горла — это некоторые из побочных эффектов, описанных после вдыхания ГВ: они могут значительно снизить приверженность лечению. 5
Гиалуроновая кислота (НА) представляет собой полисахарид, присутствующий в тканях человека; вдыхаемый HA был протестирован не только при CF, но и при астме. 6 HA блокирует острый бронхоспазм, вызванный эластазой нейтрофилов 7 , и, регулируя баланс жидкости в интерстиции легких, способствует вентиляции и газообмену. Кроме того, вдыхаемый раствор HS + 0,1% HA более приятен по сравнению с одним HS. 8
Свистящее дыхание — обычное явление у людей с МВ, но никаких рекомендаций по клиническому ведению этой категории случаев не было. Кроме того, лечение HA фактически не имеет четких показаний при CF.
Описание клинического случая
Авторы описывают случай мальчика с МВ, европеоидной национальности, 13 лет, тест пота: Cl — 103 мэкв / л; Генотип: F508del / G542X; внешнесекреторная недостаточность поджелудочной железы. Пациент был хронически колонизирован метициллин-устойчивым Staphylococcus aureus (MRSA) в возрасте от 7 лет до 1 года назад, с повторным положительным результатом мазка из зева на Candida albicans . В течение последних 12 месяцев мазки из зева всегда оказывались положительными на метициллин-чувствительный Staphylococcus aureus .Культуральные тесты на Pseudomonas aeruginosa всегда были отрицательными. Состояние питания было хорошим, индекс массы тела 20,12 (60-й центиль, Standard Rolland-Cachera). В раннем детстве у пациента развились рецидивирующие инфекции верхних дыхательных путей (URI), связанные с симптомами, подобными астме.
Исследования
Бумажный радиоиммуносорбентный тест (PRIST) 437 kU / l с положительным уколом и радиоаллергосорбентным тестом (RAST) для Dermatophagoides farinae , Dermatophagoides pteronyssinus , катхиллиум 9029 sperithelium и b.Объем форсированного выдоха за одну секунду (FEV 1 ) + 16% от пред. постингаляция сальбутамола 200 мкг.
Дифференциальный диагноз
Лечение
Пациент с 4 лет начал пероральное антигистаминное лечение (цетиризин 0,15 мг / кг 1 раз в сутки) и ингаляционную поддерживающую терапию кортикостероидами (будесонид 0,5 мг 2 раза в день) и бронходилататорами. (сальбутамол 2,5 мг 2 раза в сутки).
Учитывая рецидивирующий URI, связанный с хрипом, пациенту требовались частые курсы пероральных антибиотиков, обычно амоксициллин + клавулановая кислота или триметоприм + сульфаметоксазол, и пероральная стероидная терапия (бетаметазон, 0.1–0,2 мг / кг) ().
Гиалуроновая кислота улучшает «приятность» и переносимость распыленного гипертонического раствора в группе пациентов с муковисцидозом.
С мая по июль 2008 г. пациент начал ингаляционную терапию 7% NaCl, которой предшествовал спрей сальбутамола 200 мкг; За 3 мес терапии мы не наблюдали улучшения легочной функции (стабильные значения ОФВ 1 ) и частоты обострений при прогрессирующей непереносимости лечения (появление кашля и бронхоспазма).
В марте 2009 г. мы начали давать пациенту аэрозольный раствор 7% NaCl + 0,1% HA (Hyaneb — 5 мл один раз в день, после чего вводили спрей сальбутамола 200 мкг). Эта терапия все еще продолжается, и первые дозы хорошо переносятся. Другие поддерживающие методы лечения не изменились.
Результат и наблюдение
Мы рассмотрели 7-летнее наблюдение:
В течение первых 42 месяцев наблюдения пациенту было проведено 23 курса пероральных антибиотиков (0,55 курса / мес.), Из которых 11 — с сопутствующей пероральной стероидной терапией (0.26 курсов / мес).
В течение последних 42 месяцев (после начала терапии HS + HA) мы наблюдали значительное уменьшение респираторных обострений и рецидивов антибактериальной терапии (четыре курса антибиотиков; 0,10 курса / месяц), при этом больше не применялись пероральные стероиды.
С начала лечения мы наблюдали постепенное увеличение ОФВ 1 в течение первых нескольких месяцев (с 78% до 103%) с последующей стабилизацией до значений около 100% от пред.Последний ОФВ 1 102% (). Последний ПРИСТ 271 кЕд / л. Вероятно, в результате меньшего использования антибиотиков, больше не было обнаружено положительных результатов в отношении C. albicans или других грибов. С начала лечения HS + HA не было никаких других изменений в терапии или образе жизни, и половая зрелость еще не наступила.
Обсуждение
Бронхиальная гиперреактивность, не связанная с АБЛА, может быть обнаружена у людей с МВ; Пациенты с «сопутствующей астмой» могут быть определены по повторяющимся эпизодам хрипов, клинически поддающихся лечению бронходилататорами. 9 Эти пациенты могут пройти несколько курсов антибиотиков в детстве, что может привести к клиническим и микробиологическим последствиям. На самом деле в литературе нет данных о лечении и клиническом ведении этих пациентов.
HA представляет собой биополимер, выполняющий несколько функций в тканях человека, таких как барьерные эффекты, гомеостаз воды и мукоцилиарный клиренс. ГК обладает способностью связывать и удерживать молекулы воды и изменять морфогенез тканей, рост и гидратацию клеток 10 из-за его влияния на объем интерстициального пространства и проницаемость мембраны.ГК в аэрозольной форме тестировалась у пациентов с астмой против бронхоспазма, вызванного физической нагрузкой; в этих нескольких исследованиях результаты не были уникальными, и на самом деле ГК имеет очень ограниченное применение при астме.
На сегодняшний день в литературе мало работ о HS + HA при CF, и они в основном сосредоточены на приятности. В нашем центре мы используем HS + HA у пациентов, которые не переносили HS; в описанном случае мы наблюдали, помимо хорошей переносимости, также резкое уменьшение рецидивов курсов антибиотиков при прекращении приема пероральных стероидов и, после хорошего начального выздоровления (+ 25% ОФВ 1 ), стабильность легочного функция.
Как сообщалось в недавнем большом исследовании, снижение ОФВ 1 у пациентов с МВ, постоянно инфицированных MRSA, составляет примерно -2,06% от прогнозируемого / год, 11 , тогда как у нашего пациента в течение последних 3 лет мы наблюдали небольшое увеличение ОФВ. 1 (около + 1,33% прогноз / год).
В заключение, мы думаем, что этот случай предлагает возможное показание для ингаляционной ГК, особенно у пациентов с МВ с астматическими симптомами и аллергической сенсибилизацией. Дальнейшие исследования будут иметь решающее значение для определения показаний и полезности HA при CF.
Очки обучения
Ведение людей с одышкой и муковисцидозом.
Новая терапевтическая стратегия для людей с муковисцидозом и астматическими симптомами.
Возможное определенное показание для вдыхания гиалуроновой кислоты при муковисцидозе
Сноски
Авторы: F-C, A-N и F-F проанализировали данные и написали статью. R-C отредактировал документ. Она поручитель.
Конкурирующие интересы: Нет.
Согласие пациента: Получено.
Провенанс и экспертная оценка: Не введен в эксплуатацию; внешняя экспертная оценка.
Ссылки
1. Дэвис Дж., Розенталь М., Буш А. Тяжелое заболевание мелких дыхательных путей, не поддающееся лечению, у ребенка с муковисцидозом. J R Soc Med 1996; 2013: 172P – 3P [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 2. Валлийский MJ, Смит AE. Молекулярные механизмы дисфункции хлоридных каналов CFTR при муковисцидозе.Клетка 1993; 2013: 1251–4 [PubMed] [Google Scholar] 3. Элкинс М.Р., пока, PT. Ингаляционный гипертонический раствор для лечения муковисцидоза. Curr Opin Pulm Med 2006; 2013: 445–52 [PubMed] [Google Scholar] 4. Турино GM, Кантор О. Гиалуронан при травмах и восстановлении органов дыхания. Am J Respir Crit Care Med 2003; 2013: 1169–75 [PubMed] [Google Scholar] 5. Ратьен Ф. Вдыхаемый гипертонический раствор вызывает небольшое улучшение функции легких у пациентов с муковисцидозом. J Педиатр 2006; 2013: 142. [PubMed] [Google Scholar] 6. Kunz LIZ, van Rensen ELJ, Sterk PJ.Ингаляционная гиалуроновая кислота против вызванного физической нагрузкой бронхостеноза при астме. Пульм Фармакол Тер 2006; 2013: 286–91 [PubMed] [Google Scholar] 7. Скури М, Авраам ВМ. Гиалуронан блокирует реакцию дыхательных путей овец, вызванную нейтрофильной эластазой человека (HNE). Пульм Фармакол Тер 2003; 2013: 335–40 [PubMed] [Google Scholar] 8. Буонпансьеро П., Де Грегорио Ф, Сепе А. и др. Adv Ther 2010; 2013: 870–8 [PubMed] [Google Scholar] 9. Ван Асперен П.П., Манглик П., Аллен Х. Механизмы гиперреактивности бронхов при муковисцидозе.Педиатр Пульмонол 1988; 2013: 139–44 [PubMed] [Google Scholar] 10. Лоран УБГ, Рид РК. Оборот гиалуронана в тканях. Adv Drug Deliv Rev 1991; 2013: 237–56 [Google Scholar] 11. Сандерс ДБ, Биттнер Р.К., Розенфельд М. и др. Невозможность восстановления исходной функции легких после обострения муковисцидоза легких. AM J Respir Crit Care Med 2010; 2013: 627–32 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] Анализ транскриптомапочечной ишемии / реперфузионного повреждения и его модуляция с помощью ишемического прекондиционирования или лечения гемином
Дизайн и анализ исследования
В соответствии с хирургическими процедурами и процедурами лечения мышей разделили на пять групп: контрольная, IRI, животные, предварительно обработанные Hemin с последующим IRI (Hemin + IRI), животные, обработанные только Hemin (Hemin), и животные, предварительно обработанные и подвергнутые IRI (IPC + IRI).Креатинин сыворотки измерялся в группах, чтобы проверить, повлияло ли состояние IRI на почечную функцию и смогло ли лечение IPC и Hemin избежать почечной дисфункции (рис. 1). Чтобы определить последствия IRI, обработки Hemin или IPC в профиле экспрессии генов, были проведены следующие статистические сравнения между группами: IRI против контроля, IPC + IRI против контроля, IPC + IRI против IRI, IRI + Hemin против IRI и Hemin против Control.Эти сравнения описаны с точки зрения данных и биологически значимых результатов, полученных ниже.
Рис. 1. Среднее ± стандартное отклонение концентраций креатинина в сыворотке, обнаруженных у мышей, подвергшихся различным экспериментальным манипуляциям.
Самцов мышей C57BL / 6 подвергали хирургическим и лечебным процедурам, как описано в разделе «Материалы и методы». Уровни креатинина сыворотки измеряли с использованием модифицированной методики Джаффе. * Группы статистически сравнивались с использованием ANOVA с последующим апостериорным тестом Тьюки с p <0.05.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0049569.g001
IRI
по сравнению с ControlПосле процедур статистического тестирования, удаления транскриптов без идентификатора гена Entrez и отсечения кратных изменений (Fold ≥3 для генов с повышенной регуляцией и Fold ≥2 для генов с пониженной регуляцией), мы идентифицировали набор из 483 дифференциально активируемых и регулируемых генов. 361 ген с пониженной регуляцией в результате IRI. Эти гены были подвергнуты функциональному анализу обогащения через базы данных GO (Gene Ontology) и KEGG (Kyoto Encyclopedia Genes and Genomes), и основные биологические функции, представленные в чрезмерном количестве, показаны на рисунке 2.Интересно, что некоторые из генов, наиболее активно регулируемых с точки зрения кратности изменения (Таблица S1 — Cdkn1a, Serpine1, Hmox1, Ccl2 и Plaur), участвуют в сигнальном пути индуцируемого гипоксией фактора-1 (HIF-1), главного регулятора клеточного адаптивные ответы на гипоксию во время IRI, которые, как было показано в других исследованиях, защищают почки от этого повреждения, например, посредством ангиогенеза, индуцированного ишемией [14]. Фактически, многие гены, транскрипционно контролируемые HIF и участвующие в ангиогенезе, активируются после IRI (Таблица S6– Ангиогенез).Также следует отметить, что некоторые гены, которые регулируются активацией протеазо-активируемого рецептора-2 (PAR2), такие как Fosl1, Serpin1 и Tnfrsf12a, представлены в таблице S1. PAR2 участвует в регуляции цитокинов и воспалительных состояний в исследованиях на мышах с генетическим нокаутом [15]. Во время IRI протеазы, высвобождаемые из разных источников (например, из воспалительных клеток), могут активировать или повышать регуляцию PAR2. Было показано, что агонисты PAR2 повышают эффективность ишемического прекондиционирования в сердце [16] и улучшают функциональное восстановление миокарда после IRI [17].Следовательно, этот белок может быть возможной важной мишенью для изучения заболеваний, связанных с ишемией почек, из-за его потенциальной защитной активности.
Рис. 2. Лучшие биологические функции после ишемии / реперфузии почек.
A) Категории KEGG, демонстрирующие значительные обогащенные функции для дифференциально экспрессируемых генов при сравнении IRI и Контроль; Б) Онтология биологического процесса (GO) дифференциально экспрессируемых генов, наблюдаемых при сравнении IRI и контроля.Гистограмма представляет собой процент генов, дифференциально экспрессируемых и функционально аннотированных в изолированной ткани почек. Цвета столбиков представляют собой регулируемые гены с повышением (красный) и вниз (зеленый).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0049569.g002
IPC + IRI
по сравнению с IRIВо время подготовительного периода ишемии могут выделяться многие вещества, вызывающие воспаление. Эти вещества связываются с мембранными рецепторами и активируют внутриклеточные сигнальные каскады, которые, в конце концов, защищают почки от IRI.Чтобы получить представление о механизме защиты IPC в почках, мы сравнили группы IPC и IRI, чтобы понять, какие гены, биологические процессы и сигнальные пути могут быть вовлечены в него. После процедур статистического тестирования, удаления транскриптов без идентификатора гена Entrez и отсечения кратного изменения (гены со кратным изменением ≥3) мы обнаружили набор из 248 генов с повышенной и 24 отрицательной регуляции, дифференциально экспрессируемых из-за IPC. Эти гены были функционально обогащены важными биологическими темами, согласно рисунку 3 или таблицам S8 и S9.Наиболее 25 обнаруженных здесь генов с повышенной и 24 подавляющей регуляции представлены в Таблице S2.
Рис. 3. Высшие биологические функции, связанные с предварительным кондиционированием ишемии почек.
A) Категории KEGG, демонстрирующие значительные обогащенные функции для дифференциально экспрессируемых генов при сравнении IPC + IRI и IRI; B) Онтология биологического процесса (GO) дифференциально экспрессируемых генов, наблюдаемых при сравнении IPC + IRI и IRI. Гистограмма представляет собой процент генов, дифференциально экспрессируемых и функционально аннотированных в изолированной ткани почек.Цвета столбиков представляют собой регулируемые гены с повышением (красный) и вниз (зеленый).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0049569.g003
IPC + IRI
по сравнению с ControlСравнение между IPC и контрольными группами проводили для оценки различий в экспрессии генов между животными, подвергнутыми предварительному ишемическому кондиционированию с последующим IRI и контрольными условиями. После процедур статистического тестирования, удаления транскриптов без идентификатора гена Entrez и отсечения кратных изменений (кратное изменение ≥4 для генов с повышенной регуляцией и кратное изменение ≥2 для генов с пониженной регуляцией), мы обнаружили набор из 564 генов с повышенной экспрессией. и 115 генов с пониженной регуляцией, дифференциально экспрессируемых из-за условий IPC + IRI.Эти гены были функционально обогащены важными биологическими темами, согласно рисунку 4 или таблицам S10 и S11. Стоит отметить, что наши результаты в почечной модели IPC согласуются с данными, наблюдаемыми в модели IPC с использованием культур срезов гиппокампа взрослых крыс [18]. В обоих случаях были активированы гены, относящиеся к сигнальным путям, таким как MAPK, Wnt, ErbB и Toll-подобный рецептор. Это говорит о том, что, возможно, одни и те же механизмы могут наблюдаться для МПК в разных органах или экспериментальных моделях.25 генов с наибольшей активацией и 25 генов с наибольшей подавляемой регуляцией, полученные в этом сравнении, перечислены в Таблице S3.
Рис. 4. Биологические функции, занимающие первое место после предварительного кондиционирования ишемии почек и ишемического / реперфузионного повреждения.
A) Категории KEGG, демонстрирующие значительные обогащенные функции для дифференциально экспрессируемых генов при IPC + IRI против Сравнение контроля; B) Онтология биологического процесса (GO) дифференциально экспрессируемых генов при IPC + IRI против Контрольное сравнение.Гистограмма представляет собой процент генов, дифференциально экспрессируемых и функционально аннотированных в изолированной ткани почек. Цвета столбиков представляют собой регулируемые гены с повышением (красный) и вниз (зеленый).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0049569.g004
IRI + Hemin
по сравнению с IRIГемин способен обратить вспять фиброз почечных канальцев и интерстициальный фиброз [19], процесс, связанный с исходом почечной недостаточности. Хотя роль гемина в модуляции окислительного стресса и воспаления уже была описана, необходимо рассмотреть общую картину молекулярных механизмов, участвующих в этой защите.В этом порядке сравнивали группы IRI + Hemin и IRI, чтобы установить, какие гены, пути и биологические процессы модулируются обработкой гемином. После процедур статистического тестирования и удаления транскриптов без идентификатора гена Entrez мы идентифицировали набор из 306 активированных и 29 подавляемых генов в результате обработки гемином перед IRI. Эти гены были функционально обогащены некоторыми основными биологическими темами, как показано на Рисунке 5. Для набора активированных генов наиболее значимыми чрезмерно представленными биологическими функциями были регуляция транскрипции, развития, митоза, ответа на ион металла, регуляция дифференцировки клеток, белок. локализация, опосредованный гормонами сигнальный путь, транспорт РНК, сокращение гладких мышц сосудов, сигнальный путь Wnt, метаболизм арахидоновой кислоты и метаболизм аминокислот.Для набора генов с пониженной регуляцией наиболее важными биологическими функциями были апоптоз, сборка пучков актиновых нитей, организация актинового цитоскелета, регуляция пролиферации клеток, транспорт белков, ответ на гипоксию, транспорт ионов натрия, путь передачи сигналов толл-подобных рецепторов, синтез и деградация кетоновых тел и циркадного ритма. 25 генов с наибольшей активацией и 25 генов с наибольшей отрицательной регуляцией, полученные в этом сравнении, представлены в Таблице S4.
Рисунок 5.Лучшие биологические функции после ишемии / реперфузии почек у мышей, получавших предыдущее лечение гемином.
A) Категории KEGG, демонстрирующие значительные обогащенные функции для дифференциально экспрессируемых генов при сравнении IRI + Hemin и IRI; B) Онтология биологического процесса (GO) дифференциально экспрессируемых генов при IRI + Hemin и сравнение IRI . Гистограмма представляет собой процент генов, дифференциально экспрессируемых и функционально аннотированных в изолированной ткани почек.Цвета столбиков представляют собой регулируемые гены с повышением (красный) и вниз (зеленый).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0049569.g005
Hemin
по сравнению с ControlПредыдущая индукция Hmox1 в почечной ткани является способом уменьшения последующих пагубных последствий заражения IRI [20]. С целью оценки генов, путей и биологических процессов, вовлеченных в этот наблюдаемый лучший ответ против IRI, было проведено сравнение между Hemin и контрольной группами.После процедур статистического тестирования, удаления транскриптов без идентификатора гена Entrez и отсечения кратных изменений (гены со кратностью изменения ≥3) мы обнаружили 346 гена с повышенной регуляцией из-за лечения гемином. Эти гены были функционально обогащены некоторыми основными биологическими темами, как показано на рисунке 6. Наиболее важными из представленных биологических функций были регуляция транскрипции, развития, клеточного цикла, регуляция передачи сигнала, репарация ДНК, каскад MAPKKK, регуляция дифференцировки клеток, сплайсинг РНК. , каскад свертывания и метаболизм аминокислот.25 генов с наибольшей активацией, обнаруженных в этом сравнении, перечислены в Таблице S5.
Рис. 6. Высшие биологические функции после обработки гемином.
A) Категории KEGG, демонстрирующие значимые обогащенные функции для дифференциально экспрессируемых генов при сравнении Hemin и Control; B) Онтология биологического процесса (GO) дифференциально экспрессируемых генов в Hemin против Контрольное сравнение. Гистограмма представляет собой процент генов, дифференциально экспрессируемых и функционально аннотированных в изолированной ткани почек.Цвета столбиков представляют собой регулируемые гены с повышением (красный) и вниз (зеленый).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0049569.g006
Ответы транскриптома раскрывают основные биологические функции, модулируемые IRI, IPC и Hemin
Далее мы обсудим основные клеточные явления, модулируемые IRI, IPC и обработкой Hemin согласно нашим данным. Эти чрезмерно представленные биологические функции могут объяснять некоторые защитные механизмы, с помощью которых лечение IPC и гемином может сохранять функции почек после ишемического стресса.Также интересно, что мыши, подвергнутые IRI, показали дифференциальную экспрессию генов, принадлежащих не только к вредным, но и предполагаемым защитным биологическим функциям. Это показывает, что программа транскриптома, вызванная ишемией, также может иметь отношение к противодействию защите от IRI.
Стресс-реакция.
Ответ на стресс был чрезмерно представлен после условий IRI и IPC (таблицы S6 и S10, соответственно), что подчеркивает важность борьбы со стрессом клеток в условиях гипоксии.Гены с высокой степенью дифференциации экспрессии, наблюдаемые здесь после IRI (таблица S1) и IPC + IRI (таблица S3), такие как ATF3 и CHAC1, экспрессируются в ответ на фосфорилирование eIF2α, общий путь, участвующий в ответе на различные стрессы. Было продемонстрировано, что фосфорилирование eIF2α контролирует приверженность апоптозу во время осмотического стресса, своего рода стресса, испытываемого при IRI [21], [22], и что ATF3 функционирует как ген-протектор против IRI [22]. Кроме того, гипоксия, испытываемая при IRI, вызывает ингибирование синтеза белка за счет активации ответа развернутого белка (UPR), адаптивного сигнального пути, который способствует выживанию клеток при накоплении развернутых белков в эндоплазматическом ретикулуме (ER).Ингибирование трансляции во время этого события вызывается фосфорилированием eIF2α через его киназу PERK (протеинкиназа-подобная киназа эндоплазматического ретикулума), присутствующая в ER [23]. В отличие от острой адаптивной активации UPR, хроническая активация увеличивает экспрессию проапоптотических медиаторов, что приводит к массивному апоптозу почечных клеток [24].
Апоптоз.
Здесь мы обнаружили, что гены, принадлежащие к передаче сигналов p53 и апоптозу, по-разному экспрессировались в группах IRI, IPC + IRI и IRI + Hemin, что подчеркивает важность модуляции апоптоза после стрессовых событий.Апоптоз эпителиальных клеток почечных канальцев играет важную роль в развитии острой почечной недостаточности [25], поскольку воздействие клеточного стресса запускает фактор-супрессор опухоли p53, вызывая остановку роста клеток или апоптоз. Передача сигналов p53 играет важную роль в изменении эпителиальных клеток канальцев после IRI почек [26], а ингибиторы p53 способны защищать почки от IRI [27], [28]. Более того, активация p53 смягчает сопутствующую активацию защитной передачи сигналов HIF после IRI, и, таким образом, баланс между ответами HIF-1 и p53 может определять исход IRI [29].
MAPK pathway.
Как показано на рисунке 2, передача сигналов митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) была наиболее широко представленной темой после IRI. MAPK опосредуют реакцию клеток на широкий спектр физиологических и связанных со стрессом стимулов, включая тепловой шок, ишемию, свободные радикалы кислорода и гиперосмоляльность — все стрессы, испытываемые при IRI. Было высказано предположение, что активность MAPKs, включая JNK, p38 и ERK, заметно усиливается после ишемии in vivo . Кроме того, относительная степень активации JNK, p38 или ERK была предложена для определения судьбы клеток после повреждения (выживаемость клеток, некроз или апоптоз) при постишемии / реперфузии [30].Следовательно, активация MAPK может определять выживаемость почечных эпителиальных клеток во время окислительного повреждения, и различия в клеточном исходе различных областей нефронов могут быть связаны со специфической активацией разных MAPKs [31]. Кроме того, путь MAPK принимает непосредственное участие в передаче сигнала нижестоящего, связанного с врожденным иммунным ответом и последующей продукцией провоспалительных цитокинов. Таким образом, сбалансированная регуляция этого биохимического пути очень важна для тщательного контроля среды воспаления, создаваемой IRI [32].
Активность p38 MAPK, JNK и ERK1 / 2, а также некоторых ферментов выше и ниже этих путей регулируется их статусом фосфорилирования. Более того, сложная сеть негативных регуляторных механизмов, присутствующих в передаче сигналов MAPK, предотвращает вредные эффекты врожденного иммунного ответа. Часть этого механизма обратной связи связана с инактивацией MAPK фосфатазами [33]. Примечательно, что здесь было обнаружено, что многие сигнальные фосфатазы MAPK сверхэкспрессируются после IRI (Table S6– MAPK pathway).Важный класс фосфатаз с двойной специфичностью (DUSP) был значительно активирован, что показывает важность этого класса ферментов для регуляции передачи сигналов MAPK в этом контексте. Также важно то, что передача сигналов MAPK была наиболее активированной функционально обогащенной функцией, наблюдаемой при сравнении IPC + IRI и Control. В самом деле, некоторые исследования уже рассматривали активацию передачи сигналов MAPK с помощью IPC и IRI [34], [35]. Более того, после обработки Hemin (Hemin x Control) каскад MAPKKK также был одной из слишком широко представленных тем.Взяв эти многочисленные доказательства вместе, можно предположить, что ослабление эффектов повреждения почек с помощью MAPK является важной повесткой дня для будущих исследований, которые следует полностью изучить.
Врожденный иммунный ответ и передача сигналов JAK / STAT.
Перенос основных клеточных компонентов врожденного иммунитета в постишемические почки стимулируется экспрессией нескольких хемокинов. Например, CCL2 и CXCL1 (активированные гены, Таблица S1 и Таблица S3) соответственно привлекают макрофаги и нейтрофилы к месту повреждения.Кроме того, высвобождение провоспалительных цитокинов, таких как IL-6, TNF-α и IL-1β, опосредует функцию врожденного иммунитета в локальном участке IRI. В нашем исследовании было обнаружено, что многие гены, кодирующие эти цитокины, имеют повышенную регуляцию, как это обобщено в теме «Взаимодействие цитокинов и рецепторов цитокинов» (Рисунок 2). Более того, провоспалительный сигнальный путь JAK / STAT был чрезмерно представлен анализом KEGG (рис. 1). Фактически, исследование продемонстрировало участие передачи сигналов JAK / STAT в патогенезе почечного IRI, при этом его блокада приводит к ослаблению почечного повреждения у крыс [36].Таким образом, наши результаты показывают, что путь JAK / STAT также может служить потенциальной мишенью для раннего вмешательства при ишемической острой почечной недостаточности.
Toll- и NOD-подобные рецепторы.
Как видно из рисунков 2 и 4, пути передачи сигналов от Toll-подобных (TLR) и NOD-подобных рецепторов (NLR) были чрезмерно представлены после IRI и IPC + IRI. Эти рецепторы, которые распознают общие молекулярные паттерны, участвуют в воспалительной реакции, проявляющейся при острых и хронических заболеваниях почек [37], [38], [39].Эта активность опосредуется их активацией эндогенными лигандами, высвобождаемыми из поврежденных тканей, такими как гиалуронан, фибронектин и белки теплового шока. Также эпителиальные клетки почечных канальцев увеличивают экспрессию TLR при остром повреждении почек [2]. Мы обнаружили, что экспрессия TLR-2 изменялась после IPC и что экспрессия CD14, корецептора передачи сигналов TLR-4, повышалась после IRI и IPC. Передача сигналов TLR-4 / CD14 уже была описана как клеточный индикатор острого повреждения почек из-за активации воспалительного пути ядерного фактора κB (NF-κB) [40], а также генов, связанных с каскадом I-kappaB киназы / NF-kappaB. были активированы после IRI (Таблица S6).Эта линия доказательств предполагает, что воспалительное обострение, вызванное передачей сигналов TLR-4 / CD14 / NF-κB в почках, может быть вредным, и, таким образом, эти пути могут быть хорошей мишенью для модуляции. Более того, сравнение IRI + Hemin и IRI показало, что сигнальный путь TLR был одной из слишком широко представленных биологических тем с пониженной регуляцией (фиг. 5). Этот результат подчеркивает важность этой передачи сигналов в модуляции IRI с помощью Hemin.
Помимо TLR, участие семейства NLR в IRI не установлено, хотя белки NOD-1 и NOD-2 экспрессируются в эпителиальных клетках почечных канальцев после IRI [41].Кроме того, другое исследование показало, что мыши с нокаутом NOD-2 имеют более низкие уровни сывороточного креатинина, мочевины, провоспалительных цитокинов и хемокинов, а также меньшие площади ишемического канальцевого некроза по сравнению с животными дикого типа, подвергнутыми IRI [42]. Следовательно, будущие исследования должны быть выполнены для оценки значимости передачи сигналов NLR в IRI и определения того, как эти рецепторы связаны с клиническим ухудшением или улучшением.
Пути дифференциации и развития.
Лечение IRI, IPC и Hemin способствовало активации генов, относящихся к дифференцировке и развитию клеток (рисунки 2, 4, 5 и 6; таблицы S6, S7, S8, S10, S12 и S14), подчеркивая их роль в стрессе. -связанные события. При потере почечных эпителиальных клеток из-за IRI выжившие клетки дедифференцируются, мигрируют по базальной мембране, пролиферируют, восстанавливая количество клеток, а затем дифференцируются, восстанавливая функциональную целостность нефрона [43]. Также интересно, что молекулы, которые экспрессируются во время развития почек, но не в зрелом нефроне, в огромной степени экспрессируются в проксимальных канальцах после IRI.Хотя значение возврата к менее дифференцированному клеточному фенотипу во время IRI неясно, этот феномен должен быть хорошо понят, учитывая его значимость для прогрессирования хронической болезни почек.
Сигнальный путь ангиотензина II.
Ренин-ангиотензин-альдостероновая система, особенно пептид Ангиотензин II (Ang II), способствует повреждению почек [44]. Гены, принадлежащие к этой биологической теме, были подавлены в сравнении IRI против контроля и IPC + IRI против IRI сравнений (рисунки 2 и 3, соответственно).Фактически, одним из наиболее подавляемых генов в IRI по сравнению с контролем (Таблица S1) был рецептор Ang II AT1B. Это показывает попытки почек подавить экспрессию AT1B и, следовательно, уменьшить повреждение почек, вызванное передачей сигнала этого рецептора. Более того, становится все более очевидным, что перекрестное взаимодействие между Ang II и др. Сигналами, такими как ErbB, посредством гетеродимеризации соответствующих рецепторов может играть критическую роль в почечной деградации и гипертрофии почечных эпителиальных клеток [45], [46].Следовательно, подавление рецепторов Ang II также может быть ответом на этот потенциально опасный перекрестный ток.
Фокальная адгезия и взаимодействие ЕСМ-рецептора.
Фокальная адгезия и взаимодействие ЕСМ-рецептора были двумя другими чрезмерно представленными темами, наблюдаемыми из дифференциально экспрессируемых генов, обнаруженных после IRI (Рисунок 2). Взаимодействия между клеткой и внеклеточным матриксом опосредуются семейством интегринов рецепторов клеточной адгезии в очаговых адгезиях, которые состоят из большого количества как цитоскелетных, так и адаптивных белков передачи сигнала [47].Стрессовые события, такие как IRI, могут дезорганизовать фокальные спайки за счет реструктуризации актинового цитоскелета и активации некоторых нижестоящих киназ, таких как ERK1 / 2, что вызывает нарушение фокальной адгезии и последующее повреждение почек [48]. Здесь мы обнаружили повышенную регуляцию генов, которые участвуют в функциях фокальной адгезии и взаимодействия с рецептором ECM, таких как CD44, тенасцин и некоторые интегрины, которые уже были описаны при патологических состояниях почек [49], [50], [51]. Как молекулы адгезии, они могут потребоваться, чтобы избежать массивного отслоения эпителиальных клеток канальцев в ответ на ишемию, не допуская разборки фокальных комплексов адгезии, присутствующих в этом контексте.Однако они могут также способствовать другим функциям, таким как определение клеточной судьбы и экстравазация лимфоцитов к пораженному месту, с поддержанием провоспалительной среды в ишемической почке [52]. Таким образом, сохранение целостности канальцевого эпителия и фокальных адгезионных взаимодействий, поддерживающих этот эпителий, может быть интересным терапевтическим подходом для поддержания стабилизации почечной функции [53].
Регуляция актинового цитоскелета.
Гены, участвующие в регуляции актинового цитоскелета, были активированы при IRI по сравнению с контролем (Рисунок 2, Таблица S6) и подавлены в IRI + Hemin x IRI (Рисунок 5, Таблица S13) и IPC + IRI по сравнению с IRI. сравнения.Актиновый цитоскелет играет важную роль в структуре и функции эпителиальных клеток проксимальных канальцев, модулируя адгезию клетка-клетка и клетка-внеклеточный матрикс (ECM). Ишемия ремоделирует нитчатый актин, отделяя эпителиальные клетки проксимальных канальцев, что может частично привести к острой почечной недостаточности. Более того, истощение клеточного АТФ в различных типах клеток приводит к чистому превращению мономерного G-актина в полимерный F-актин, что представляет собой важный аспект клеточного повреждения ишемической ткани.Среди обнаруженных дифференциально экспрессируемых генов Rock2 активируется в IRI (Таблица S6), который участвует в полимеризации актинового цитоскелета во время ишемических условий. Примечательно, что ингибирование ROCK гидроксифасудилом значительно улучшает функцию почек на крысиной модели острого почечного IRI [54]. Кроме того, мы обнаружили, что лечение гемином и предварительное ишемическое кондиционирование способны подавлять экспрессию гена, кодирующего профилин (Pfn1). Pfn1 — это актин-связывающий белок, участвующий в механизме полимеризации актина при истощении клеточного АТФ [55].Следовательно, регулирование полимеризации актина может быть важной повесткой дня для будущих исследований защиты от нарушения функции почек.
Сигнальный путь Wnt.
Гены сигнального путиWnt по-разному регулировались в IPC + IRI против IRI (рисунок 3), IPC + IRI против контроля (рисунок 4, таблица S10) и IRI + Hemin против IRI (рисунок 5, таблица S12 ) сравнения. Это открытие может указывать на то, что передача сигналов Wnt может играть важную роль в защите почек, вызванной манипуляциями IPC и Hemin.В самом деле, становится все более очевидным, что передача сигналов Wnt способна защищать почки от апоптоза путем ингибирования активности Bax, Caspase 3 и Cytochrome c, что в конечном итоге приводит к ишемической устойчивости [56], [57]. Напротив, другие исследования связывают передачу сигналов Wnt с прогрессированием хронического повреждения почечного аллотрансплантата [58] и почечного фиброза [59]. Возможно, как это ни парадоксально, наблюдаемый противоположный эффект может быть связан с зависимостью от контекста и сложностью этого пути, который подвергается многим уровням перекрестного взаимодействия с другими регуляторными путями.Следовательно, предсказать, как модуляция пути Wnt может влиять на почечный IRI, становится сложно [60]. Следует отметить, что предыдущие исследования рассматривали роль передачи сигналов Wnt в прекондиционировании кардиопротекции [61], [62], подтверждая идею, что некоторые компоненты пути Wnt участвуют в механизмах выживания, вызываемых IPC.
Сосудистые события.
Гены, принадлежащие к категории «Сокращение гладких мышц сосудов», были активированы при сравнении IRI + Hemin и IRI (фигура 5, таблица S12).Предыдущее исследование продемонстрировало, что мыши с нокаутом Hmox1 обнаруживают обострение сосудистых поражений после ишемии / реперфузии [63], а их артерии проявляют повышенную чувствительность к констрикторам. Более того, уже было продемонстрировано, что лечение гемином улучшает микроциркуляцию за счет индукции Hmox1 в IRI после трансплантации почки [64]. Следовательно, Hmox1 может играть важную роль в регуляции функции сосудов в стрессовых ситуациях, испытываемых почками. Hmox1 может нейтрализовать вазоконстрикторные медиаторы, высвобождаемые в IRI, уравновешивая пагубные последствия этих медиаторов для функции почек.Также актуально, сравнение IRI + Hemin и IRI показало повышенную регуляцию генов, принадлежащих к категории «сигнальный путь рецептора фактора роста эндотелия сосудов» (рис. 5, таблица S12), что, в свою очередь, может помочь почкам избежать постоянного ишемия за счет стимулирования местного ангиогенеза.
Аминокислотный и азотный обмен.
Обработка гемином усиливала экспрессию генов, участвующих в метаболизме аминокислот и азота (таблицы 12 и 14; фигура 6). Это открытие может указывать на механизм повышения толерантности к ишемии посредством метаболической адаптации через усиление метаболизма аминокислот.Интересно, что введение регуляторных аминокислот, таких как фенилаланин, триптофан и аланин, показало защитные эффекты против ишемии на модели ишемии печени [65]. Таким образом, метаболизм азота может играть важную роль в сохранении жизнеспособности печени.
Идентификация общих и исключительно регулируемых генов между группами.
Диаграмма Венна была построена для идентификации общих и исключительно активируемых генов с помощью протоколов лечения IRI, IPC и Hemin (рис. 7A).Мы обнаружили, что гены 136, 189 и 469 экспрессируются исключительно в условиях IPC, IRI + Hemin или IRI. Хотя несколько генов обычно активировались между IRI и контролем и двумя другими сравнениями, описанными выше, 108 генов обычно экспрессировались между сравнениями IPC x IRI и IRI + Hemin x IRI, что указывает на возможные общие механизмы между маневрами IPC и Hemin. Основные общие биологические функции включали транскрипцию, репликацию ДНК, метаболический процесс ДНК, клеточный цикл, регуляцию полимеризации / деполимеризации микротрубочек, организацию центросом и сигнальный путь рецептора стероидных гормонов (рис. 7В).Напротив, данные, представляющие подавленные гены, не показали репрезентативного количества обычно дифференциально экспрессируемых генов (данные не показаны). Фигура 8 представляет собой анализ функционального обогащения исключительно экспрессируемых генов в сравнениях IPC x IRI и IRI + Hemin x IRI, классифицированных по KEGG и GO. Примечательно, что IPC исключительно индуцировал экспрессию генов, участвующих в плотном контакте, биосинтезе стероидных гормонов, сигнальном пути NOD-подобных рецепторов, протеолизе, ответе на стресс и апоптоз, организации цитоскелета микротрубочек и миграции клеток.С другой стороны, предварительная обработка гемином была способна исключительно индуцировать экспрессию генов, связанных с метаболическими путями, сокращением гладких мышц сосудов, метаболизмом арахидоновой кислоты, регуляцией актинового цитоскелета, сигнальным путем Wnt, метаболизмом ретинола, метаболизмом лекарств — цитохром Р450, дифференцировка клеток, окислительно-восстановительный процесс, клеточный цикл, митоз и каскад MAPK.
Рис. 7. Диаграмма Венна результатов микроматрицы показывает сходства и различия в профилях дифференциальных транскриптомов, регулируемых протоколами IRI, IPC Hemin.
A) Диаграмма Венна, визуализирующая перекрывающиеся результаты между дифференциально регулируемыми генами, обнаруженными при сравнении IRI против контроля, IRI + Hemin против IRI и IPC + IRI против IRI. B) Онтология биологического процесса (GO) , обычно дифференциально экспрессируемых генов, обнаруженных при сравнении IPC + IRI против IRI и IRI + Hemin против IRI сравнений. Красный цвет столбиков представляет собой активированные гены.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0049569.g007
Рис. 8. Лучшие биологические функции исключительно дифференциально экспрессируемых генов, регулируемых IPC и обработкой гемином.
A) Категории KEGG, демонстрирующие значительное функциональное обогащение исключительно дифференциально экспрессируемых генов, обнаруженных при сравнении IPC + IRI против IRI и IRI + Hemin против IRI сравнений. B) Онтология биологического процесса (GO) исключительно дифференциально экспрессируемых генов, обнаруженных при сравнении IPC + IRI против IRI и IRI + Hemin против IRI.Красный цвет столбиков представляет собой активированные гены.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0049569.g008
Проверка результатов микрочипа с помощью qRT-PCR.
Паттерны экспрессии всех выбранных генов (таблица S15), использованные для проверки микрочипов, соответствовали значениям, полученным с помощью qRT-PCR. Нормализацию проводили с использованием гена домашнего хозяйства гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (Hprt). На рисунках 9, 10 и 11 представлены результаты qRT-PCR, подтверждающие согласованность данных микрочипа.Мы обнаружили хорошую корреляцию между результатами микроматрицы и qPCR в оцениваемых генах (коэффициент корреляции Пирсона, r = -0,7849), что соответствует другим статьям в литературе, которые показали аналогичные результаты [66], [67], [68] . Кроме того, проведенный линейный регрессионный анализ показал значение p = 0,0005, что указывает на то, что наклон линии регрессии значительно отличается от нуля, что, в свою очередь, показывает, что существует значимая взаимосвязь между «значениями кПЦР» и «значениями микроматрицы ДНК». переменные.
Рис. 9. Подтверждение результатов микрочипа с помощью анализа qRT-PCR.
Экспрессию генов Hmox-1 (A), Fosl1 (B) и Cxcl1 (C) оценивали с помощью микрочипов и экспериментов qRT-PCR. В экспериментах с микрочипами значения представлены преобразованным в log2 сигналом gProcessed. Для qRT-PCT относительные количества РНК рассчитывали с использованием сравнительного метода 2- ΔΔCT и Hprt в качестве внутреннего контроля. Результаты отображаются в формате прямоугольной диаграммы с усами от минимальных до максимальных значений.* p <0,05 по сравнению с контролем.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0049569.g009
Рис. 10. Проверка результатов микрочипа с помощью анализа qRT-PCR.
Экспрессию генов Ccl5 (A), Hoxd4 (B), Muc20 (C) и Socs3 (D) оценивали с помощью микрочипов и экспериментов qRT-PCR. В экспериментах с микрочипами значения представлены преобразованным в log2 сигналом gProcessed. Для qRT-PCT относительные количества РНК рассчитывали с использованием сравнительного метода 2- ΔΔCT и Hprt в качестве внутреннего контроля.Результаты отображаются в формате прямоугольной диаграммы с усами от минимальных до максимальных значений. * p <0,05 по сравнению с контролем; ** p <0,05 по сравнению с IRI; *** p <0,05 по сравнению с Hemin.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0049569.g010
Рисунок 11. Линейный регрессионный анализ выявил хорошую степень корреляции (R 2 = 0,6161) между олигонуклеотидным микрочипом и количественной ОТ-ПЦР.
Горизонтальная ось, значения, полученные в экспериментах с микрочипами; вертикальная ось — значения, полученные с помощью qRT-PCR.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0049569.g011
Выводы
Ишемия / реперфузионное повреждение по-прежнему является серьезной клинической проблемой при многих заболеваниях почек, а также преобладающим инсультом при трансплантации органов. В настоящей работе мы провели транскриптомный анализ реакции почек на IRI на мышиной модели острого повреждения почек. Кроме того, мы сравнили IRI с двумя отдельными вмешательствами: предварительным ишемическим лечением и лечением гемином.
Наш подход к функциональной геномике интегративно выявил профили дифференциальных транскриптомов и последующие расширенные биологические функции между группами, обеспечивая общую картину того, как почка ведет себя после IRI. Хотя в предыдущих работах уже рассматривалась дифференциальная экспрессия генов после IRI на животных моделях [69], [70], [71], [72], [73], в этих исследованиях использовались наборы микрочипов, содержащие гораздо меньше зондов, чем здесь (44000 олигонуклеотидных зондов). соответствует примерно 42000 стенограмм).Следовательно, в нашем исследовании было обнаружено много новых релевантных генов, обновляющих текущую информацию о регуляции транскриптома после IRI. Кроме того, наши результаты согласуются с этими предыдущими исследованиями микрочипов, подтверждая участие генов, связанных с апоптозом, воспалением, внеклеточным матриксом, стрессовой реакцией, факторами роста, молекулами адгезии, протеазами и т. Д. Примечательно, что наблюдалась согласованная часть дифференциально экспрессируемых генов в этой работе участвует в биологических функциях, ранее описанных как защита от IRI.Следовательно, клетки почек пытаются вызвать потенциальную программу защитного транскриптома после выявления IRI.
Поврежденные клетки могут высвобождать молекулы иммунологического образца, которые распознаются почками и иммунологическими клетками, вызывая стойкое воспаление. Обострение и распространение медиаторов воспаления в другие области нефрона может привести к стойкому повреждению системы. В соответствии с этой идеей, растворимые медиаторы воспаления, такие как TGF-β, ангиотензин II и EGF, сигналы которых, как было описано в нашей работе, были изменены, могут вызывать некоторые побочные эффекты в почках.Это может влиять на ангиостаз, клеточные реакции, фиброз [74] и другие патофизиологические процессы, такие как эпителиально-мезенхимальный переходный процесс, при котором поврежденные канальцевые клетки, пытающиеся регенерировать почечную систему, повторяют ее развитие [75]. Соответственно, исследования, направленные на настройку этих путей, могут прояснить, в каких условиях эти сигналы могут вызывать усиленный ответ на повреждение, в зависимости от таких факторов, как время, место высвобождения и конкретные медиаторы.
Повышающая регуляция Hmox1 уже была описана как общий механизм защиты, обеспечиваемой Hemin и IPC в других экспериментальных моделях [64], [76], [77], [78].Широко известно, что лечение гемином вызывает экспрессию Hmox-1 [11], [19], [79], [80], [81]. Более того, некоторые недавние статьи показали, что в разных органах защитные эффекты IPC, по крайней мере, частично опосредуются через повышающую регуляцию Hemox-1 [82], [83], [84], [85]. Кроме того, некоторые исследования показали, что ингибирование Hmox-1 (либо путем фармакологического ингибирования, либо с помощью siRNA) вызывает потерю защитных эффектов IPC [76], [86], что еще раз подтверждает роль системы гемоксигеназы-1. в восстановлении тканей.
Помимо описанного ранее механизма, были также получены новые знания о механизмах, лежащих в основе защиты почек от IRI, которые способствуют лечению IPC и Hemin. Анализ диаграммы Венна помог нам идентифицировать перекрывающиеся дифференциально экспрессируемые гены, что, в свою очередь, может указывать на потенциальные общие и различные механизмы, участвующие в этих маневрах (Рисунки 7 и 8). Оба маневра были способны модулировать гены, принадлежащие к репликации ДНК, пролиферации, клеточному циклу, полимеризации микротрубочек и организации центросом.В совокупности эти результаты предполагают, что в обоих случаях в ткани почек происходит активизация путей, которые способствуют восстановлению клеток. Соответственно, одним из основных путей сверхэкспрессии после обработки Hemin и IPC является передача сигналов MAPK, которая участвует в делении клеточного цикла и, следовательно, в пролиферации. В качестве примера этого каскада недавняя статья показала, что когда существует фармакологическое вмешательство, которое приводит к ингибированию передачи сигналов MAPK, выздоровление после эпизода острого повреждения почек задерживается [87].
Анализ диаграммыВенна также показал нам некоторые возможные исключительные механизмы между Hemin и IPC. IPC исключительно регулирует экспрессию генов, относящихся к процессам модификации белков, таким как протеолиз, реакция на стресс и регуляция апоптоза. Таким образом, была подчеркнута роль МПК в контроле обострения стрессовой реакции и, как следствие, модификаций белков и апоптоза. Наконец, лечение гемином регулирует исключительно экспрессию генов, связанных с дифференцировкой клеток, метаболическими путями, клеточным циклом, митозом, развитием, регуляцией актинового цитоскелета и метаболизма арахидоновой кислоты, что свидетельствует о плейотропном эффекте гемина.
В этой работе мы тестировали только изменения экспрессии генов с интервалом в 6 часов. Таким образом, необходимо провести дальнейшие исследования для оценки временной экспрессии выбранных генов с биологической значимостью, чтобы подтвердить, какие изменения являются временными или стойкими. Мы нашли уместным этот временной интервал, потому что неопубликованные данные нашей лаборатории показали, что пик экспрессии Hmox-1 происходит примерно через 6 часов после реперфузии, что дает разумные доказательства того, что этот временной момент должен быть лучшим для сравнения изменений между группами, показанными в нашей рукописи. .Поскольку мы сосредоточились на анализе транскриптома, мы полагаем, что выбранный момент времени может предоставить нам важную информацию о молекулярных изменениях экспрессии генов, которые позже будут влиять на результат функции почек, как наблюдали наша группа и другие [10], [88] ], [89]. Кроме того, этот анализ временной экспрессии генов может прояснить некоторые вопросы, так как многие результаты в литературе показывают противоположные роли одних и тех же сигналов, при этом продолжительность конкретных путей формирует переключение между одним и другим ответом [90].
Хотя использованный здесь функциональный анализ обогащения был полезен для идентификации возможных релевантных генов и путей, ограничение настоящего исследования состоит в том, что мы смогли обнаружить только пути, гены которых регулируются транскрипционной активностью. Однако другие соответствующие мишени, которые не регулируются на уровне транскрипции, возможно, не были раскрыты. Эти мишени, возможно, могут регулироваться метаболически, в зависимости от статуса фосфорилирования или других косвенных эффектов IPC или лечения гемином.
Таким образом, функциональный транскрипционный анализ, проведенный в этой работе, позволил обнаружить новые мишени, биологические процессы и сигнальные пути, связанные с IRI и ренопротекторной защитой. Дальнейшее изучение обнаруженных здесь молекулярных механизмов требует понимания патофизиологических изменений, происходящих при почечной IRI. Более того, дальнейшие исследования по оценке защитных свойств лечения ППК и Гемина могут стать важной повесткой дня для открытия эффективных методов лечения заболеваний почек, связанных с ишемией.
Амфирегулин, полученный из проксимальных канальцев, усиливает и интегрирует сигналы профибротических рецепторов EGF при фиброзе почек
% PDF-1.4 % 1 0 объект > эндобдж 4 0 obj > поток doi: 10.1681 / ASN.20121application / pdf
MyD88 сигнальный путь участвует в фиброзе почек путем поддержки иммунного ответа TH 2 и активации альтернативных макрофагов M2 | Молекулярная медицина
Исследования на животных
Самцы TLR2, TLR4, MyD88, IL-4, IL-12 и Rag-1 мышей с нокаутом (KO) у H-2 b фоновых и контрольных C57Bl / 6 в возрасте от 6 до 8 недель были выведены и размещены в помещении, свободном от патогенов.Их держали на 12-часовом цикле свет: темнота в помещении с регулируемой температурой 21–23 ° C, со свободным доступом к воде и пище. Мышей анестезировали кетамин-ксилазином (Agribrands do Brazil, Сан-Паулу, Бразилия). На день 0 УУО была выполнена полной перевязкой правого мочеточника. Для каждой группы в серии экспериментов пять мышей были подвергнуты UUO и пять использовались в качестве фиктивных мышей. Все процедуры были одобрены внутренним этическим комитетом Университета Сан-Паулу (№ 45/2009).
Результаты почечной функции
Соотношение белок: креатинин в моче измеряли в образцах, взятых из непроходимого таза и мочевого пузыря через 7 дней после операции.Все образцы были проанализированы колориметрическими анализами с использованием приобретенных в продаже наборов для измерения креатинина и белка (Labtest, Minas Gerais, Brazil). Отношение нормализовали путем деления соотношения при d 7 на соотношение до операции в каждой группе животных.
Количественная оценка фиброза
Почки собирали в 10% забуференном формальдегиде для фиксации. В итоге предметные стекла депарафинизировали, регидратировали и погружали в насыщенный раствор пикриновой кислоты на 15 минут, а затем в пикросириус еще на 20 минут.Контрастное окрашивание проводили гематоксилином Харриса. Срезы, окрашенные пикросириусом, анализировали с помощью микроскопа Olympus BX50 с прикрепленной камерой Olympus. Были сделаны ручные снимки коры головного мозга с 40-кратным увеличением и наблюдались в поляризованном свете. Были сделаны фотографии не менее 10 различных полей на каждом слайде, и были исключены такие структуры, как клубочки, субкапсулярная кора, крупные сосуды и продолговатый мозг. Для морфометрического анализа часть обработки и анализа изображений в программном обеспечении ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA; https: // doi.org / rsbweb.nih.gov / ij /). Результат анализа был представлен в процентах и относился к соотношению объема к общему объему коркового интерстициального пространства.
Иммуногистохимия
Иммуногистохимия была проведена с использованием микроволнового метода извлечения антигена. Ранее предметные стекла депарафинизировали, регидратировали и помещали в раствор для извлечения антигена Tris-EDTA, pH 9, при 95 ° C. Активность эндогенной пероксидазы блокировали с помощью 3% перекиси водорода и добавляли раствор для блокировки белка (DAKO, Glostrup, Дания).Срезы инкубировали с коллагеном I типа (разведенным 1: 300; Abcam, Кембридж, Массачусетс, США) и FSP-1 (разведенным 1: 600; A5114; DAKO, Ely, UK) антителами или реагентом отрицательного контроля с последующей инкубацией. с меченым полимером (Dual Link SystemHRP; DAKO, Glostrup, Дания) с использованием двух последовательных 30-минутных инкубаций при комнатной температуре. Окрашивание завершали путем инкубации в течение 1–3 мин с 3,3-0-диаминобензидиновым субстратом-хромогеном, в результате чего на участке антигена образовывался осадок коричневого цвета.Было проведено контрастное окрашивание гематоксилином.
Количественное определение гидроксипролина
Аликвоты стандартного гидроксипролина (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) или образцы почек гидролизовали в щелочи. Затем гидролизованные образцы смешивали с забуференным реагентом хлораминов-Т, и окислению давали возможность продолжаться в течение 25 минут при комнатной температуре. Затем хромофор проявляли с добавлением реактива Эрлиха, и оптическую плотность красновато-пурпурного комплекса измеряли при 550 нм с помощью спектрофотометра.Значения абсорбции наносили на график в зависимости от концентрации стандартного гидроксипролина, а присутствие гидроксипролина определяли с использованием стандартной кривой (21).
Количественный анализ в реальном времени
Суммарную РНК выделяли из замороженной ткани почек с использованием реагента TRIzol (Invitrogen; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) и протокола согласно In-vitrogen. Концентрации РНК определяли по показаниям спектрофотометра при оптической плотности 260 нм. КДНК первой цепи были синтезированы с использованием обратной транскриптазы MML-V (Promega, Мэдисон, Висконсин, США).Полимеразную цепную реакцию в реальном времени (ОТ-ПЦР) проводили с использованием анализа TaqMan для ПЦР в реальном времени (Applied Biosystems, Life Technologies) для следующих молекул: HPRT (Mm01545399_m1), фактор некроза опухоли (TNF) -α (Mm00443258_m1 ), TLR2 (Mm00442346_m1), TLR4 (Mm00445273_m1), MyD88 (Mm00440338_m1), GATA-3 (Mm01337569_m1), TBX21 (Mm00450960_m1), коллаген 1-го типа (Mmgin), IL-9 (Mmgin), IL-910 (Mmgin), ILS1 (Mmg1) (Mm04) (Mm001) (Mm0111) (Mm001) (1) (Mm00498739_m1), iNOS (Mm00440485_m1) и TGF-β (Mm03024053_m1).Условия цикла были следующими: 10 минут при 95 ° C, затем 45 циклов по 20 секунд каждый при 95 ° C, 20 секунд при 58 ° C и 20 секунд при 72 ° C. Для анализа использовали программное обеспечение системы обнаружения последовательностей (SDS) версии 1.9.1 (Applied Biosystems, Life Technologies). Экспрессию мРНК нормализовали по экспрессии HPRT.
Проточная цитометрия
Проникающие клетки анализировали с помощью многоцветной проточной цитометрии. Используемые моноклональные антитела: F4 / 80 PerCP, CD11b PE, CD206 FITC, MIG PE, IL-10 APC, p40 (IL-12 / IL-23) PE, CD4 Pacific Blue, IL-4 PerCP, IFN-γ FITC ( все приобретены в BD Biosciences, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США).Образцы собирали на FACSCanto с использованием программного обеспечения FACSDiva (BD Biosciences), а затем анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Ashland, OR, США). Напряжения флуоресценции определяли с использованием согласованных неокрашенных клеток. Было зарегистрировано двести тысяч событий в живом мононуклеарном гейте, и процесс компенсации производился по методу «флуоресценция минус один».
Определение цитокинов с помощью иммуноферментного анализа
Лизаты тканевых белков получали путем взвешивания замороженной ткани и помещения образцов в соответствующее количество буфера для лизиса с ингибиторами протеаз.Концентрации белка определяли с помощью анализа белка Брэдфорда (Thermo Scientific, Рокфорд, Иллинойс, США). Общий белок почечного IL-13 (eBioscience, Сан-Диего, Калифорния, США) и TGFβ1 (TGFβ1 Emax ImmunoAssay Systems, Promega) измеряли в соответствии с инструкциями производителя. Результаты представлены в пг цитокина / мг общего белка, измеренного с помощью анализа Брэдфорда (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США).
Активность аргиназы
Образцы почек гомогенизировали в буфере для лизиса и центрифугировали в течение 30 минут при 14000 g при 4 ° C.Вкратце, образцы лизатов инкубировали с 10 ммоль / л MnCl2 и 50 ммоль / л трис-HCl (pH 7,5). Реакцию гидролиза L-аргинина аргиназой проводили путем инкубации смеси, содержащей активированную аргиназу, и останавливали добавлением раствора кислоты. Для калориметрического определения мочевины добавляли α-изонитрозопропиофенон, и смесь нагревали при 100 ° C в течение 45 мин. После помещения образца в темноту на 10 мин при комнатной температуре концентрацию мочевины определяли спектрофотометрически по оптической плотности при 550 нм.
Подготовка липосом и истощение макрофагов
Хлодронат (Bonefos, Schering, São Paulo, Brazil) был захвачен липосомами путем инъекции эфира, как описано ранее (22). Обычно 0,5 мл эфирного раствора, содержащего 50 мг фосфатидилхолина и 8 мг холестерина, вводили (0,2 мл / мин) в 5 мл водного раствора 50 ммоль / л хлодроната, поддерживаемого при 42 ° C. Суспензию липосом центрифугировали при 22800 g в течение 30 мин (Hitachi Himac CR20B2 centrifuge, Hitachi, Troy, MI, USA) при 25 ° C.Осадок, содержащий липосомы, дважды промывали центрифугированием в тех же условиях в растворе NaCl 0,9% (мас. / Об.). Конечный осадок ресуспендировали в 2 мл физиологического раствора. Обычно конечные концентрации фосфатидилхолина и хлодроната в липосомах составляли 10 ммоль / л и 0,5 ммоль / л соответственно. Выход захваченного клодроната составил около 1% от начального добавленного количества. Мышам внутрибрюшинно (IP) вводили 100 мкл липосомного препарата (6 мкг клодроната) за 24 ч до операции UUO.Кроме того, 200 мкл липосомального препарата (12 мкг клодроната) вводили внутрибрюшинно во время операции и через 3 дня.
Генерация химерных мышей BM
Самцов мышей в возрасте 6-8 недель с нокаутом по IL-4 и IL-12 (KO) облучали (общее облучение тела 11 Гр в течение 1597 с). Через час мышей восстанавливали 5 × 10 6 клеток костного мозга (BM) от доноров-самцов IL-12 или IL-4 KO. В течение первых 2 недель после трансплантации BM мыши получали 0,2% ципрофлоксацин (Cipronil; Farmabase, Jaguariuna, Brazil) с питьевой водой.UUO выполняли через 6 недель после периода восстановления приживления, чтобы произошло полное восстановление клеток костного мозга.
Статистика
Данные были описаны как среднее значение и стандартная ошибка среднего (SEM). Различия между группами сравнивали с использованием дисперсионного анализа (ANOVA) (с апостериорным тестом Tukey ) и критерия Стьюдента t . Достоверные различия были расценены как P <0,05. Все статистические анализы выполнялись с помощью Graph-Pad PRISM (GraphPad Software Inc., Ла Хойя, Калифорния, США).
Все дополнительные материалы доступны в Интернете по адресу https://doi.org/www.molmed.org.
Питательные вещества | Бесплатный полнотекстовый | Добавки с рыбьим жиром уменьшают воспаление, но не восстанавливают функцию почек и экспрессию лоханки при ХБП, индуцированной аденином. Модель
1. Введение
Воспаление играет центральную роль в патогенезе и прогрессировании хронической болезни почек (ХБП). Активация врожденных и адаптивных ответвлений иммунного ответа приводит к инфильтрации клеток (в основном макрофагов) и выработке провоспалительных молекул, что в конечном итоге приводит к отложению коллагена и потере функции почек [1].Белок α-Klotho был первоначально идентифицирован как ген против старения в 1997 году, а позже был признан трансмембранным корецептором фактора роста фибробластов (FGF23) [2]. В здоровых условиях Klotho представляет собой белок, высоко экспрессируемый в дистальных извитых канальцах почек [3], который в гомеостатических условиях также может присутствовать в растворимой форме в крови, моче и спинномозговой жидкости. Soluble Klotho выполняет несколько эндокринных функций, таких как антистарение, антиоксидантная, антипочечная ангиотензин-альдостероновая система (РААС) и противовоспалительная модуляция [4].Дефицит Klotho связан со снижением функции почек, гиперфосфатемией, повышенным уровнем FGF23, активацией РААС и хроническими осложнениями, такими как эктопическая кальцификация, гипертрофия сердца, вторичный гиперпаратиреоз и прогрессирование ХБП [4,5]. Klotho-дефицитные грызуны демонстрируют проявления ХБП, и, наоборот, модели ХБП грызунов показывают заметно сниженную экспрессию мРНК Klotho [4]. Причины, по которым Klotho снижается у пациентов с ХБП, полностью не поняты, но, похоже, воспаление может быть одной из основных механизмы.Экзогенное введение TWEAK (слабый индуктор апоптоза, подобный фактору некроза опухоли) снижает почечную экспрессию Klotho, а блокада TWEAK нейтрализующими антителами восстанавливает почечную экспрессию Klotho [6]. Эти данные предполагают наличие двунаправленной связи между Klotho и воспалением. Следовательно, стратегии лечения, направленные на воспаление почек, могут потенциально восстановить экспрессию Klotho, уменьшая повреждение почек и предотвращая сопутствующие заболевания. Омега-3 жирные кислоты, такие как докозагексаеновая (DHA) и эйкозапентаеновая (EPA), обладают противовоспалительным действием и могут обладать рено-защитными свойствами при заболеваниях почек [7,8].Экспериментальные данные показали снижение инфильтрации тубулоинтерстициальных клеток, провоспалительных медиаторов, таких как циклооксигеназа-2 (ЦОГ-2) и хемоаттрактантный белок-1 моноцитов (MCP-1), а также ослабление фиброза [9]. Кроме того, мы ранее наблюдали, что более высокое потребление EPA-DHA было независимо связано с более низкими уровнями FGF23 у реципиентов почечного трансплантата [10], предполагая, что омега-3 жирные кислоты могут благоприятно влиять на ось FGF23-Klotho. В настоящем исследовании мы исследовали, увеличивает ли рыбий жир, богатый омега-3 жирными кислотами, экспрессию Klotho в почках и снижает воспаление и фиброз почек на мышиной модели воспалительной ХБП.2. Материалы и методы
2.1. Модель животных
Мышей дикого типа C57BL / 6 в возрасте от 8 до 12 недель получали из местного учреждения. Все процедуры были разработаны в соответствии с международными рекомендациями по уходу за лабораторными животными и одобрены Комитетом по этике животных Федерального университета Сан-Паулу (CEUA, 1558280214). Чтобы гарантировать, что воспаление и фиброз почек были индуцированы в этой модели адениновой ХБП, первоначальные эксперименты проводились в течение 10 дней в двух группах, которые получали либо стандартную диету (7.0% соевого масла, группа CTL, n = 5) или та же диета, обогащенная 0,25% аденином (группа AD, n = 5). После подтверждения воспаления и фиброза почек в модели были инициированы две дополнительные экспериментальные группы для оценки воздействия добавок рыбьего жира. Обе группы получали добавки аденина к стандартной диете в течение 10 дней. С 11-го дня введение аденина было прекращено, и животные были либо переведены обратно на их стандартную диету (7,0% соевого масла, группа после AD-CTL, n = 9), либо начали получать добавки с рыбьим жиром (6.3%, группа после AD-рыбий жир, n = 9) в течение 7 дополнительных дней (см. Схему эксперимента на рисунке 1a). Диеты были приобретены в Ростере, Арасояба-да-Серра, Бразилия, и соответствовали рекомендациям Американского института питания (AIN 93G). В конце исследования животных анестезировали ксилазином (10 мг / кг) и кетамином (50 мг / кг) путем внутрибрюшинной инъекции для взятия пробы крови путем сердечной пункции и после этого подвергали эвтаназии. Почки собирали и немедленно рассекали, промывали физиологическим раствором, заливали в парафин, делали продольные срезы и регулярно обрабатывали для гистологического исследования.Оставшуюся часть быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C. Креатинин сыворотки измеряли по модифицированному методу Джаффе, а уровень мочевины в сыворотке измеряли с помощью набора Labtest Kit (Minas Gerais, Brazil) в соответствии с инструкциями производителя.2.2. ПЦР в реальном времени
IL-6 (Mm00446190_m1), IL-1β (Mm00434228_m1), TGF-β (Mm01178820_m1), HPRT (Mm00446968_m1), CXCL10, CXCL9 и экспрессия гена Klothorase в реальном времени оценивались с помощью экспрессии генов полимеразы в реальном времени. Реакция (ПЦР). Почечные ткани измельчали и гомогенизировали, и для экстракции РНК из всех образцов использовали набор RNeasy Mini Purification Kit (Qiagen, Валенсия, Калифорния, США).Количественное определение РНК проводили с использованием спектрофотометра NanoDrop (спектрофотометр NanoDrop ND-1000; Thermo Scientific, Уилмингтон, Делавэр, США). Концентрацию нуклеиновой кислоты определяли с помощью ультрафиолетовой спектрофотометрии при 260 нм, а чистоту определяли с использованием коэффициентов поглощения 260/280 и 260/230. РНК подвергали обратной транскрипции с использованием набора QuantiTec SYBR Green Kit (Qiagen) с соблюдением инструкций производителя. Обратную транскрипцию и ПЦР в реальном времени проводили с использованием коммерчески доступных реагентов и термоциклера 7500 Fast Real-Time (Applied Biosystems, Карлсбад, Калифорния, США).Для относительной количественной оценки экспрессии сообщения (метод ΔCT) экспрессию целевого гена нормализовали по экспрессии гена гипоксантинфосфорибозилтрансферазы (HPRT).
Следующие праймеры были оценены для количественной ОТ-ПЦР Syber Green:
KLOTHO fw: GGTGTCCATTGCCCTAAGCTC; KLOTHO rev: TCGGTCATTCTTCGAGGATTGA. CXCL9 fw: 5-TGCACGATGCTCCTGCA-3; CXCL9 ред.: 5-AGGTCTTTGAGGGATTTGTAGTGG-3. CXCL10 fw: 5-GACGGTCCGCTGCAACTG-3; CXCL10 ред.: 5-GCTTCCCTATGGCCCTCATT-3.
2.3.Гистологическая оценка
Фиксированные формальдегидом парафиновые срезы почек (3 мкм) депарафинизировали и окрашивали раствором Пикросириуса. Срезы погружали в насыщенный раствор пикриновой кислоты на 15 минут, а затем в Picrosirius еще на 20 минут. Контр-окрашивание проводили гематоксилином Харриса. Срезы, окрашенные пикросириусом, анализировали с помощью микроскопа Olympus BX50 (Olympus, Feasterville, PA, USA) с прикрепленной камерой Olympus. Были сделаны ручные снимки коры головного мозга с 40-кратным увеличением и наблюдались в поляризованном свете.Были сделаны фотографии не менее пяти различных полей на каждом слайде, и были исключены такие структуры, как клубочки, субкапсулярная кора, крупные сосуды и продолговатый мозг. Снимки были оцифрованы в HP Scanjet 2400 (Hewllet Packard, Barueri, Сан-Паулу, Бразилия), а затем интерстициальный объем коллагена в коре головного мозга по сравнению с общей площадью коры был количественно оценен с помощью морфометрии. Для морфометрического анализа использовалась программа обработки и анализа изображений на Java (Image J — программа обработки изображений, Национальные институты здравоохранения, Мэриленд, Мэриленд, США).Результат анализа представлен в виде процента объема интерстициального кортикального коллагена по отношению к общему объему интерстициального кортикального слоя. Впоследствии для каждого слайда вычислялось среднее арифметическое проанализированных полей. Коллаген типа I был связан с желто-красным двойным лучепреломлением, а тип III — с зеленым цветом, согласно описанию Montes GS и Junqueira LC [11]. Оценка объема интерстициального фиброза, полученная с помощью морфометрического анализа цифрового изображения, окрашенного пикросириусом, была основана на предыдущих исследованиях [12].2.4. Вестерн-блоттинг
Здесь 50 мкг общего белка было получено из почечного лизата мышей CTL, AD, Post-AD-CTL и Post-AD-рыбий жир. Белковый экстракт денатурировали нагреванием в течение 5 минут при 95 ° C и разделяли электрофорезом в 10% полиакриламидном геле (SDS-PAGE). Затем белковый экстракт переносили в нитроцеллюлозную мембрану, а затем проводили иммуноокрашивание следующими первичными антителами: E-кадгерин (Dako: M3612, Санта-Клара, Калифорния, США), альфа-актин гладких мышц (α-SMA, DAKO: M0851). , Санта-Клара, Калифорния, США), Клото: (CosmoBIO: K0603, Карлсбад, Калифорния, США) и α-тубулин (InVitrogen: 32-2500, Саннивейл, Калифорния, США).Затем нитроцеллюлозную мембрану инкубировали с конъюгированными вторичными антителами (против кроличьей или антимышиной пероксидазы / 1: 125,0000, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) и выявляли методами хемилюминесценции с использованием набора ECL (Millipore, Burlington, США). Массачусетс, США). Наконец, изображение было получено на Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Мальборо, Массачусетс, США) и проанализировано с помощью Image J.
2.5. Статистический анализ
Различия между группами AD и CTL и группами после AD-CTL по сравнению с группами после AD-рыбьего жира оценивали с использованием t-критерия Стьюдента.Все статистические анализы были выполнены с использованием GraphPad Prism версии 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Результаты представлены как среднее значение и стандартное отклонение для параметрических переменных. Различия считались достоверными, если р <0,05.
4. Обсуждение
Несколько факторов способствуют подавлению экспрессии Klotho при ХЗП, включая уремические токсины, дефицит витамина D, перегрузку фосфатом, активацию РААС, окислительный стресс и воспаление [4,5]. Таким же образом экспериментальные исследования показали, что экзогенная добавка клото или его трансгенная сверхэкспрессия ослабляют повреждение почек [4,13].В различных моделях воспалительного заболевания на мышах почечная экспрессия Klotho подавлена [6,14,15,16], и Klotho также обладает противовоспалительными свойствами [17,18]. Учитывая потенциальные противовоспалительные эффекты омега-3 жирных кислот, которые в основном проявляются in vitro и in vivo [19,20], мы предположили, что рыбий жир может восстанавливать подавление Klotho на модели мышей с аденин-индуцированной ХЗП. Мы обнаружили, что добавление рыбьего жира уменьшало внутрипочечное воспаление, но было недостаточно для улучшения функции почек и интерстициального фиброза, а также для восстановления экспрессии Klotho в почках.Обоснование выбора экспериментальной модели аденин-индуцированного тубулоинтерстициального нефрита [21] основывалось на характерных особенностях прогрессирующей почечной дисфункции и интерстициального фиброза этой модели [22] в сочетании с интенсивным локальным воспалением тканей с высокой экспрессией провоспалительных цитокинов [ 12], что в конечном итоге приводит к прогрессированию болезни. Модель напоминает дефицит аденинфосфорибозилтрансферазы (APRT), редкое моногенное заболевание человека, при котором аденин не может быть восстановлен до аденозинмонофосфата, а вместо этого катаболизируется до 2,8-DHA, при котором отложение кристаллов приводит к необратимой почечной недостаточности [23,24 ].В настоящем исследовании, направленном на определение терапевтического, а не профилактического воздействия рыбьего жира на уменьшение воспалительного поражения почек, кормление аденином было прекращено на 10-й день, когда в соответствии с нашим планом эксперимента животные были возвращены в режим стандартная диета или перешли на диету с добавками рыбьего жира. В первой серии экспериментов мы обнаружили, что по сравнению с контрольной группой животные, получавшие аденин, демонстрировали значительно более высокую почечную экспрессию воспалительных маркеров, таких как IL-6 и IL-1β, а также CXCL10 (хемокин, ответственный за набор лейкоцитов). в виде повышенной экспрессии в почечной ткани α-SMA (что указывает на отложение миофибробластов) и TGF-β (суррогатного маркера фиброза).Гистоморфологические анализы подтвердили наличие кристаллов в просвете канальцев, расширение канальцев, интерстициальную инфильтрацию и лейкоцитарные цилиндры. Фиброз также был четко очевиден при окрашивании на пикросириус. Все эти результаты хорошо согласуются с другими исследованиями, в которых использовалась модель аденина TIN на мышах [12,22,25]. Как и следовало ожидать, функция почек также была снижена в группах мышей, получавших аденин, о чем свидетельствует повышение уровня мочевины и креатинина в сыворотке, что согласуется с предыдущими сообщениями [12,21,22,25]. Хотя повышение уровня креатинина в сыворотке в этой модели было описано в зависимости от времени, этот параметр уже значительно выше через 7 дней после начала кормления аденином [22].Более того, предыдущие данные нашей группы показали, что воспалительный процесс и усиленная клеточная инфильтрация, сопровождающаяся отложением коллагена, ведущим к прогрессирующей почечной дисфункции, легко устанавливается через 10 дней после приема аденина [12]. Принимая во внимание наличие ХБП [4,26,27], воспаления [15,16] или того и другого, текущие эксперименты выявили заметное снижение экспрессии почечного Klotho у этих животных, получавших аденин, подтверждая ранее опубликованные данные, которые показали чрезвычайно низкий уровень. уровни сывороточного и почечного Клото после 4 и 6 недель кормления аденином [25,28].Примечательно, что наши результаты показали еще более раннюю потерю Клото — через 10 дней. Преждевременный дефицит Klotho был описан на самой ранней стадии ХЗП (стадия 1), когда скорость клубочковой фильтрации (СКФ) все еще остается нормальной [29]. Эксперименты на животных продемонстрировали, что EPA и DHA оказывают положительное влияние на ряд моделей воспалительных состояний [30]. Тем не менее, результаты клинических испытаний на людях по профилактике воспалительных заболеваний с использованием рыбьего жира были неоднородными, без каких-либо общих четких доказательств эффективности [31].Что касается функции почек, наблюдалось небольшое положительное влияние дополнительного количества 400 мг EPA – DHA в день на функцию почек у пациентов с инфарктом миокарда в анамнезе и низким обычным потреблением EPA – DHA [8]. Однако не было получено никакого положительного воздействия на маркеры воспаления, такие как высокочувствительный С-реактивный белок (вчСРБ) [32]. Дозозависимое действие морских омега-3 полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) на воспалительные реакции не было хорошо описано, но похоже, что для достижения противовоспалительного эффекта необходима доза не менее 2 г в день, что маловероятно. получить из рациона [31].Хотя другие рандомизированные контролируемые испытания с использованием более высоких доз омега-3 жирных кислот также не показали значительного влияния на циркулирующие параметры воспаления [33,34], клинические исследования не могли исключить влияние на внутрипочечное воспаление. В настоящем исследовании рыбий жир способствовал снижению экспрессии в почках IL-6, IL-1β и CXCL9, отражая, по крайней мере частично, уменьшение внутрипочечного воспаления. Это согласуется с экспериментальными данными на грызунах, страдающих другими типами почечных повреждений, такими как нефротоксичность, вызванная такролимусом, и поликистоз почек [35,36].Несмотря на снижение маркеров воспаления, мы не наблюдали восстановления почечной экспрессии Klotho в группе рыбьего жира. Поскольку снижение уровня экспрессии Klotho в почках может повышать чувствительность почек к повреждению и обострению почечного интерстициального фиброза [37,38], следовательно, ускоряя прогрессирование почечной недостаточности, может возникнуть порочный круг. Несколько других причин могут также объяснить, почему почечная экспрессия Klotho не может быть восстановлена. Учитывая постоянную потерю функции почек в нашей модели, независимо от приема рыбьего жира, ожидается дефицит Klotho, поскольку почки производят / выпускают α-Klotho в кровоток и помогают его очистить [27].Более того, в условиях ХБП избыточная продукция активных форм кислорода [39], повышение уремических токсинов [40], высокий уровень фосфата в сыворотке / избыток FGF23 [41] и низкий уровень 1,25-дигидроксивитамина D3 в сыворотке (1,25 Vit D3), как ожидается, еще больше подавят производство клото [37,42,43]. К сожалению, в настоящем исследовании не были измерены параметры минерального метаболизма, такие как фосфат, FGF23 и 1,25 Vit D3. Другие факторы, которые могут быть объяснены почечной недостаточностью Klotho в некоторых обстоятельствах, зависят от его эпигенетической модуляции.Метилирование промотора гена Klotho, которое, как было показано, снижает его активность до 40%, может подавлять экспрессию гена Klotho при ХЗП [39,44,45], а TGF-β, как известно, вызывает глобальные изменения метилирования ДНК [46] . Соответственно, деметилирование промотора гена Klotho заметно изменило почечный дефицит Klotho и уменьшило почечный фиброз [25]. Гиперацетилирование гистона в промоторе Klotho также может вносить вклад в недостаточную экспрессию Klotho [6]. Таким образом, снижение экспрессии Klotho может быть результатом эпигенетической реакции на воспаление внутри или снаружи почек [47].Не исключена возможность задержки реакции на локальное воспаление в нашей модели. Можно утверждать, что устойчивая уремическая среда не была полностью достигнута за 10 дней, но у крыс была достигнута необратимая почечная недостаточность через 2 недели [48]. Учитывая, что почечная недостаточность прогрессирует быстрее у мышей и что текущие гистоморфометрические результаты, полученные через 7 дней после прекращения приема аденина (17-й день от исходного уровня), показали все еще важный интерстициальный фиброз, действительно, можно предположить, что последний мог быть причиной отсутствие реставрации Клото.У настоящего исследования было несколько ограничений, а также сильные стороны. Первый касается продолжительности приема аденина / лечения рыбьим жиром и возможного одновременного приема обеих добавок. Если бы лечение рыбьим жиром проводилось одновременно с диетой с добавлением аденина, не могло бы возникнуть воспаление или более короткий период воспаления, что предотвратило бы прогрессирование фиброза и потерю функции почек. В этом сценарии сокращения Клото можно было даже предотвратить.Однако, как обсуждалось выше, мы стремились определить терапевтический, а не профилактический эффект рыбьего жира на воспаление, учитывая, что в клинической практике невозможно предсказать точный момент возникновения почечного инсульта. Во-вторых, можно было использовать более высокие дозы рыбьего жира для достижения более сильного противовоспалительного эффекта. Тем не менее, было проведено несколько экспериментальных и клинических исследований по определению дозы, чтобы помочь определить оптимальные эффекты доза-ответ. Третьим ограничением настоящего исследования было то, что экспрессия молекул адгезии и хемотаксис лейкоцитов (CXCL8 и MCP1) в настоящее время не были определены в нашей модели для более точной оценки как величины, так и восстановления воспаления.Отсутствие измерения параметров минерального метаболизма, таких как фосфат, FGF23 и 1,25 Vit D3, которые участвуют в регуляции Klotho, поставило под угрозу дальнейшее обсуждение отсутствия восстановления Klotho. Наконец, мы знаем, что текущая модель представляет собой конкретный тубулоинтерстициальный инсульт без повреждения клубочков, таким образом, не отражая все типы ХБП. Для этой и других моделей ХБП необходимы дополнительные исследования, в которых использовались разные сроки и дозы лечения рыбьим жиром в этой и других моделях ХБП.