Бактериальные лизаты: Эффективность бактериальных лизатов в профилактике респираторных инфекций у детей | #09/16

Эффективность бактериальных лизатов в профилактике респираторных инфекций у детей | #09/16

Острые респираторные заболевания (ОРЗ) преобладают в структуре общей заболеваемости детей и составляют 50–60%. Основной причиной большинства ОРЗ являются респираторные вирусы и вирус гриппа, однако более чем половине детей в связи с опасением активации бактериальной флоры на фоне вирусного заболевания назначаются антибиотики. Вирусная инфекция нередко осложняется развитием бактериальной суперинфекции экзогенного или эндогенного происхождения. Актуальность нерационального использования антибактериальных препаратов при острых респираторных вирусных инфекциях (ОРВИ) связана с возможностью побочного действия антибиотиков, распространением устойчивых штаммов пневмотропных бактерий и, кроме того, излишними расходами на лечение [1].

Бактериальная этиология ОРЗ у детей, как и у взрослых, наблюдается относительно редко, но именно она представляет наибольшую угрозу развития серьезных осложнений.

Бактериальные ОРЗ вызываются относительно небольшим числом возбудителей, в основном вегетирующих в верхних дыхательных путях (табл. 1). Это пневмококки, гемолитический стрептококк группы А, бескапсульная гемофильная палочка (H. influenzae) и др. [2].

Дети раннего возраста имеют высокую восприимчивость к возбудителям ОРЗ, что обусловлено незрелостью иммунной системы ребенка, малым числом предыдущих контактов с вирусами, низким уровнем образования и активности интерферонов, несовершенным характером фагоцитоза, недостаточной барьерной функцией кожи и слизистых оболочек респираторного тракта, низким уровнем секреторного IgA. В связи с чем ослабляется противовирусная защита, облегчается адгезия и проникновение возбудителя. Несмотря на частоту респираторных инфекций у детей, важно, чтобы они протекали легко и не сопровождались развитием осложнений.

Созревание специфической иммунной защиты, Т- и В-лимфоцитов происходит у ребенка длительно, вплоть до периода полового созревания. Иммунологическая защита, полученная от матери (Ig преимущественно класса G), элиминируются полностью к 6–9 месяцам жизни ребенка, синтез же собственных иммуноглобулинов G достигнет уровня взрослого только к 6–8 годам, иммуноглобулинов А — к 10–12 годам. Поэтому риск развития ОРВИ у детей повышают такие факторы, как неблагоприятное течение беременности, недоношенность, внутриутробное инфицирование, искусственное вскармливание и другие [3]. Резервуаром инфекции может служить также носительство условно-патогенной бактериальной флоры.

Таким образом, транзиторные изменения в системе иммунитета у ребенка приводят к частым ОРЗ, но не являются признаком иммунодефицита, а связаны чаще всего с высоким уровнем контактов с источниками инфекции. В условиях детского коллектива формируется групповой иммунитет к ряду возбудителей, на что указывает высокий процент носительства при отсутствии заболеваний.

У детей с частыми рекуррентными заболеваниями дыхательных путей нередко выявляются признаки иммунного дисбаланса и недостаточность резервных возможностей иммунитета. Последствиями частых респираторных заболеваний могут быть нарушения функциональной активности иммунной системы и формирование хронических воспалительных процессов в органах дыхания [1, 3]. Учитывая вышеизложенное, профилактика рекуррентных респираторных заболеваний у детей, часто и длительно болеющих, является актуальной. Необходим индивидуализированный подход к вакцинопрофилактике, закаливанию, возможно назначение профилактических курсов иммуномодулирующих препаратов.

Наиболее эффективным и целенаправленным методом профилактики респираторных инфекций является вакцинация против основных возбудителей, например пневмококка, гемофильной палочки, вируса гриппа [4]. Однако, к сожалению, возбудителей респираторных инфекций гораздо больше, чем существующих вакцин. Кроме того, для респираторных патогенов характерна быстрая изменчивость, а специфический иммунитет против них непродолжителен. Поэтому препараты, влияющие на создание специфического иммунитета против конкретного возбудителя инфекции? дыхательных путей, имеют большое значение.

В последние годы для лечения и профилактики респираторных заболеваний активно используются иммунокорректоры бактериального происхождения, прежде всего бактериальные лизаты, вызывающие формирование селективного иммунного ответа против наиболее распространенных бактериальных возбудителей, также активирующие неспецифические механизмы врожденного иммунитета, которые помогают бороться и с бактериями, и с вирусами. Бактериальные лизаты были разработаны в целях предотвращения инфекционных заболеваний верхних и нижних дыхательных путей и представляют собой смесь антигенов, полученных из различных инактивированных бактерий, представляющих собой патоген-ассоциированный молекулярный агент, приводящий к каскаду местных иммунных реакций и стимулирующий иммунный ответ через распознающие рецепторы. Лизаты бактерий имеют двойное назначение: специфическое (вакцинирующее) и неспецифическое (иммуностимулирующее) [5].

Существуют различные препараты системного (Бронхо-мунал, Бронхо-Ваксом) и местного (ИРС 19, Имудон) действия на основе бактериальных лизатов [6].

Механизмы действия и эффективность системных и топических иммунотропных средств различны. Недостаточное воздействие местных иммуномодуляторов может быть связано с коротким временем контакта и недостаточным захватом препарата со слизистыми оболочками вследствие постоянного смывания слюной области ротоглоточного сегмента.

Бактериальные лизаты обладают рядом специфических свойств на всех стадиях иммунного ответа, благодаря которым эффективность их применения оказывается намного выше. Механизм действия заключается в стимуляции процессов фагоцитоза и презентации антигена, усилении продукции противовоспалительных цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-10, ТРФ), развитии адъювантного эффекта. При этом этот механизм оказывается самым физиологичным, так как бактериальные лизаты стимулируют собственные реакции организма на воздействие антигена и не вызывают ненужных дополнительных эффектов. Наряду с продукцией специфических антител к входящим в препараты возбудителям, они стимулируют также неспецифический иммунитет — повышается продукция секреторных IgA, интерлейкина-1 и α-интерферона, цитокинов, NK-клеток, клеток макрофагально-фагоцитарной системы и др.

[7, 8].

В многочисленных клинических исследованиях показано, что использование иммунотерапии с помощью бактериальных лизатов ведет к снижению частоты ОРВИ и их осложнений, уменьшению тяжести их течения [8].

В педиатрической практике широко используется бактериальный лизат системного действия ОМ-85 (торговое название Бронхо-мунал, Бронхо-Ваксом), подтвердивший свою эффективность и безопасность в многочисленных клинических исследованиях с высоким уровнем доказательности. ОМ-85 содержит лиофилизированный лизат наиболее частых возбудителей острых респираторных заболеваний:

Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Branchamella catarralis, Haemophilus influenzae, Klebsiella ozaenae, Streptococcus viridans и может быть использован у детей начиная с 6-месячного возраста (педиатрические формы выпуска с дозировкой бактериального лизата 3,5 мг).

При применении лизатов системного действия (ОМ-85) развитие специфического иммунного ответа происходит при кооперации Т- и В-лимфоцитов, макрофагов или дендритных клеток, после попадания антигенстимулированных клеток с поверхностным иммуноглобулином A в лимфоидные органы.

В дальнейшем специфический иммуноглобулин A вновь транспортируется на поверхность слизистых, препятствуя инвазии инфекционных агентов, их адсорбции, фагоцитозу и формированию иммунных комплексов. В то же время активация цитотоксических Т-лимфоцитов приводит к уничтожению инфицированных клеток [9].

По современным представлениям глоточная и небные миндалины являются не только самостоятельной анатомической единицей, но и частью MALT-системы (Mucosa-associated lymphoid tissue) [10]. Антигены бактериальных лизатов, контактируя с макрофагами MALT-системы миндалин, респираторного и желудочно-кишечного трактов, в последующем презентируются лимфоцитами, в результате чего появляются клоны В-лимфоцитов, продуцирующие специ­фические антитела к возбудителям, антигены которых содержатся в препарате. Миграция В-лимфоцитов в другие лимфоидные образования MALT-системы и последующая их дифференциация в плазмоциты приводят к продукции специфического секреторного IgA и развитию эффективной местной иммунной защиты против основных возбудителей острых респираторных заболеваний.

Данные механизмы способствуют уменьшению частоты носительства патогенной и условно-патогенной флоры и степени контаминации ею миндалин более чем на 50% при использовании ОМ-85 [11].

Иммунологические исследования свидетельствуют, что очевидным противоинфекционным эффектом бактериального лизата ОМ-85 является, помимо увеличения уровня специфических антител, нарастание уровней IgA как в сыворотке крови, так и в секрете дыхательных путей. IgA фиксируется на слизистых, поддерживает их барьерную функцию, взаимодействует со специфическими антигенами бактерий. Препарат улучшает показатели гуморального и клеточного иммунитета через пейеровы бляшки в слизистой оболочке кишечника, стимулирует перитонеальные макрофаги. При его применении в сыворотке крови повышается количество Т-лимфоцитов, IgA, IgG, IgМ.

Также в исследованиях продемонстрирован эффект ОМ-85 в отношении активации СD16+ клеток, повышение функциональной активности макрофагов, выработке ряда цитокинов и медиаторов (ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-2, γ-ИФН). Одновременно происходит увеличение продукции α-интерферона, снижение уровней ИЛ-4, ФНО-α, а повышение уровня IgG усиливает межклеточные взаимодействия макрофагов, натуральных киллеров. Эти сдвиги можно интерпретировать как переключение иммунного ответа Th3-типа на Th2-тип (рис. 1) [12].

Благодаря стимулированию специ­фического и неспецифического иммунного ответа применение ОМ-85 у детей с рекуррентными респираторными заболеваниями способствует снижению частоты ОРЗ, снижает вероятность бактериальных осложнений. В ряде исследований продемонстрировано снижение количества обострений хронического фарингита и среднего отита в 2 раза при применении ОМ-85 [12, 13].

Также у детей с аллергическими заболеваниями при включении ОМ-85 в комплексную терапию отмечается не только снижение частоты эпизодов респираторных инфекций, но и проявлений бронхообструкции, что может быть полезным для профилактики обострений у пациентов с бронхиальной астмой. ОМ-85, кроме того, повышает функциональную активность альвеолярных макрофагов против инфекционных и опухолевых антигенов, NK-клеток «естественных, натуральных киллеров», уменьшает выработку IgE. У детей с бронхиальной астмой и частыми интеркуррентными острыми респираторными заболеваниями применение ОМ-85 способствует клиническому улучшению в 68% наблюдений. Более чем в 2 раза сокращается заболеваемость острыми респираторными инфекциями с явлениями бронхообструкции в течение года. Уменьшается количество тяжелых приступов удушья и годовая потребность ребенка в бронходилататорах. При этом наблюдается увеличение уровня интерферона гамма, снижение общего иммуноглобулина Е и циркулирующих иммунных комплексов в крови [14].

Активизация неспецифического иммунного ответа при применении бактериальных лизатов позволяет успешно применять их в комплексной терапии острых респираторных инфекций. В исследованиях показано, что применение ОМ-85 снижает процент внутричерепных осложнений со стороны околоносовых пазух и уха у детей раннего возраста.

Назначение ОМ-85 для профилактики рецидивов хронического бронхита снижает частоту и тяжесть рецидивов, уменьшает случаи госпитализации в 1,43 раза, ее продолжительность — в 1,8 раза. У детей с хроническим риносинуситом отмечено снижение частоты рецидивов и тяжести симптомов. У часто и длительно болеющих детей при назначении ОМ-85 в 2–3 раза снижается частота ОРЗ, фарингитов, бронхитов [15].

Бактериальные лизаты можно назначать в острый период заболевания и с профилактической целью. В острый период респираторных инфекций назначение препаратов более эффективно в сочетании с этиотропной терапией. В педиатрической практике используют детские формы ОМ-85, в котором содержится половинная взрослая доза бактериального лизата (0,0035 г).

Для профилактики инфекционных заболеваний дыхательных путей препарат применяют тремя 10-дневными курсами с 20-дневными интервалами между ними. Эффект иммуномодуляторов системного действия (ОМ-85) сохраняется в течение 6 месяцев, что важно для определения интервала между курсами. У детей с частыми повторными заболеваниями в течение года показано проведение двух трехмесячных курсов по 10 дней каждый месяц.

Возможно применение препарата для лечения: в остром периоде заболевания назначают по 1 капс. /сут до исчезновения симптомов заболевания, но не менее 10 дней. В последующие 2 мес возможно профилактическое применение препарата по 1 капс. в течение 10 дней с 20-дневным интервалом между курсами. У детей раннего возраста содержимое капсулы растворяют в небольшом количестве жидкости (молоко, чай, сок).

Таким образом, ОМ-85 воздействует на различные звенья иммунного ответа, стимулирует клеточный и гуморальный иммунитет, что у детей с частыми повторными заболеваниями приводит к уменьшению частоты и тяжести инфекций, необходимости применения антибиотиков. ОМ-85 эффективен в лечении и профилактике инфекционных заболеваний и верхних, и нижних дыхательных путей.

Литература

1. Комплексный подход к лечению и профилактике острых респираторных инфекций у детей: Практическое руководство для врачей / Под ред. проф. Н. А. Геппе, проф. А. Б. Малахова. М., 2012. 47 с.
2. Simon H. B. Bacterial infections of the upper respiratory tract // ACP Medicine. 2010.
3. Самсыгина Г. А. Часто болеющие дети: проблемы патогенеза, диагностики и терапии // Педиатрия. 2005, № 1, с. 66–74.
4. Петров Р. В. Вакцинация против гриппа: проблемы и успехи // Лечащий Врач. 2007. № 9, с. 20–24.
5. Иванова Н. А. Системные бактериальные лизаты: механизм действия и показания к применению // Consilium Medicum. Педиатрия. 2015; 02: 29–32.
6. Малкоч А. В., Анастасевич Л. А., Боткина А. С. Острые респираторные заболевания и возможности иммуномодулирующей терапии // Лечащий Врач. 2008. № 5. С. 16–23.
7. Малахов А. Б., Колосова Н. Г., Хабибуллина Е. В. Бактериальные лизаты в программах профилактики респираторных инфекций у детей // Практическая пульмонология. 2015, № 4, с. 16–19.
8. Del-Rio-Navarro B. E., Espinosa Rosales F., Flenady V., Sienra Monge J. J. L. Immunostimulants for preventing respiratory tract infection in children // Cochrane Database Syst Rev. 2996; 4: CD004974.
9. SteurerStey C., Lagler L., Straub D. A., Steurer J., Bachmann L. M. Oral purified bacterial extracts in acute respiratory tract infections in childhood: a systematic quantitative review // Eur. J. Pediatr. 2007. Vol. 166, № 4. P. 365–376.
10. Cisney E. D., Fernandez S., Hall S. I., Krietz G. A., Ulrich R. G. Examining the Role of Nasopharyngealassociated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines // J. Vis. Exp. 2012. Vol. 66. P. 39–60.
11. Богомильский М. Р. Значение бактериальной иммунокоррекции в лечении болезней уха, горла и носа у детей // Трудный пациент. 2007. 10. С. 26–32.
12. Schaad U. B. OM85 BV, an immunostimulant in pediatric recurrent respiratory tract infections: a systematic review // World J. Pediatr. 2010. Vol. 6, № 1. P. 5–12.
13. Rozy A., ChorostowskaWynimko J. Bacterial immunostimulants — mechanism of action and clinical application in respiratory diseases // Pneumonol. Alergol. Pol. 2008. Vol. 76, № 5. P. 353–359.
14. Razi C. H., Harmanci K., Abaci A., Özdemir O., Hizli S., Renda R., Keskin F. The immunostimulant OM85 BV prevents wheezing attacks in preschool children // J. Allergy Clin. Immunol. 2010. Vol. 126, № 4. P. 763–769.
15. Sprenkle M. D., Niewoehner D. E., MacDonald R., Rutks I., Wilt T. J. Clinical efficacy of OM85 BV in COPD and chronic bronchitis: a systematic review // COPD. 2005. Vol. 2, № 1. P. 167–175.

---

Н. Г. Колосова, кандидат медицинских наук

ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова МЗ РФ, Москва

Контактная информация: [email protected]

Клинический эффект бактериальных лизатов в терапии респираторных и аллергических заболеваний

Вторичная иммунная недостаточность характеризуется обратимыми нарушениями иммунной системы, ее адаптационных механизмов и других функций, снижающих иммунный ответ. У пациентов с аллергическими заболеваниями респираторного тракта, часто и длительно болеющих детей имеют место клинические и иммунологические особенности инфекционного и аллергического процесса. Это послужило основанием для использования в лечении данной группы больных бактериальных лизатов, в частности OM-85. Бактериальные лизаты стимулируют как неспецифический, так и специфический иммунный ответ на воздействие бактериальных патогенов, антигены которых входят в состав OM-85. В статье приведен клинический случай применения OM-85 у пациентки с бронхиальной астмой.

Таблица. Механизм действия бактериальных лизатов

Последние десятилетия отмечается рост заболеваний, связанных с нарушениями в системе иммунитета, торпидных к адекватной этиотропной терапии. Одна из причин развития подобной патологии – сочетание различных заболеваний, в частности вирусных инфекций, хронических воспалительных заболеваний бронхолегочной системы, урогенитального тракта, гнойно-септических хирургических заболеваний, с клиническими проявлениями синдрома вторичной иммунной недостаточности (ВИН). ВИН характеризуется нарушениями работы иммунной системы, ее адаптационных механизмов и других функций, снижающих иммунный ответ. Как правило, эти нарушения обратимы.

ВИН не только осложняет течение заболеваний, в том числе аллергических, прежде всего бронхиальной астмы, аллергодерматозов, острых токсико-аллергических реакций, но и способствует генерализации инфекции, развитию осложнений, торпидности к традиционным методам лечения, инвалидизации и увеличению летальности [1, 2]. Снижение эффективности стандартной базисной терапии и наличие клинических и лабораторных признаков ВИН с различными заболеваниями потребовали разработки и определения принципов назначения иммуномодуляторов. Сегодня практикующие врачи, интерес которых к иммуномодулирующей терапии возрос, должны иметь четкие представления об иммунотропных препаратах и критериях их назначения в комплексной терапии соматических заболеваний.

Определение и характеристика иммуномодуляторов микробного происхождения

Иммуномодуляторы – лекарственные средства с иммунотропной активностью, применение которых в терапевтических дозах способствует восстановлению функции иммунной системы. Иными словами, иммуномодуляторы приводят в норму измененные показатели и не влияют на нормальные показатели [3].

В настоящее время в России зарегистрировано множество препаратов, декларируемых как иммуномодуляторы, но далеко не все из них обладают доказательной базой. Между тем к выбору препарата следует подходить с позиции именно доказательной медицины. Среди основных клинических критериев эффективности иммуномодулирующих препаратов можно выделить удлинение периода ремиссии, существенное снижение числа обострений, уменьшение потребности в антибактериальных и других химиотерапевтических препаратах, улучшение качества жизни [4]. Метаанализ Кохрейновского центра (Cochrane Collaboration) был посвящен оценке эффективности применения иммуномодулирующих препаратов микробного происхождения у детей в целях профилактики острых респираторных инфекций (ОРИ). Результаты показали, что при использовании иммуномодулирующих препаратов частота острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ) снижается в среднем на 40%.

Первыми из группы иммуномодуляторов микробного происхождения были применены бактериальные лизаты, приготовленные из различных штаммов бактерий (в частности, OM-85). Они играют роль поливалентной вакцины, увеличивая содержание специфических антител к микробам, входящим в состав препарата. О том, что клеточные органеллы, рибосомы, специализирующиеся на биосинтезе клеточных протеинов, наделены свойствами вакцины, было известно еще в 1950-е гг. [5]. Их высокий антигенный потенциал с выраженной иммуногенностью использовали при создании рибосомальных вакцин. Иммуномодулятор, полученный в результате разрушения бактериальных клеток, содержит большое число как антигенов (АГ), так и ассоциированных с микробами молекулярных паттернов (МАМП). Такой иммуномодулятор способен не только индуцировать/активировать адаптивный ответ против бактерий, АГ которых входят в состав препарата, но и потенцировать врожденные механизмы защиты от этих и других патогенов, относящихся к разным таксономическим группам. МАМП характеризуются плейотропным стимулирующим действием в отношении эффекторов врожденного иммунитета (нейтрофилов, моноцитов/макрофагов, дендритных клеток, лимфоцитов врожденного иммунитета). Кроме того, они выполняют функцию адъювантов, то есть усиливают адаптивный (АГ-специфический) ответ.

Для предотвращения и комплексного лечения инфекций дыхательных путей, полости рта и ЛОР-органов могут быть использованы лизаты бактерий, являющихся наиболее частыми возбудителями заболеваний указанных локализаций, в различных лекарственных формах (пероральной, сублингвальной, интраназальной и для рассасывания во рту) [6]. Рассматриваемую группу иммуномодуляторов можно условно разделить на препараты с преимущественно системным иммуностимулирующим действием (OM-85), основные фармакологические эффекты которых реализуются вдали от зоны первичной доставки бактериальных АГ и МАМП, и топические бактериальные лизаты, действующие главным образом в местах введения.

Необходимо учитывать, что повышенная восприимчивость к инфекциям развивается только под воздействием дополнительных неиммунологических факторов, например социально-гигиенических, а также при наличии хронических очагов инфекции, соматических заболеваний [2]. Причины повышенной заболеваемости неосложненными респираторными инфекциями в большинстве случаев остаются неясными, поэтому решение о назначении иммуномодулирующих препаратов должно основываться на клинических показаниях. Дисбактериозы слизистых оболочек, кожи, желудочно-кишечного тракта, бронхолегочной системы также способствуют изменению иммунологической реактивности организма, в то время как неблагоприятное эпидемиологическое окружение и плохая экология усугубляют патологический процесс, приводя к формированию повышенной чувствительности организма к вирусным и бактериальным инфекциям. Повторные инфекции становятся причинами острых и хронических синуситов, тонзиллитов, отитов, способствуют развитию хронической бронхолегочной и аллергической патологии, вторичной иммуносупрессии. Несмотря на перечисленные особенности иммунной системы у больных с различными хроническими соматическими заболеваниями, страдающими частыми респираторными инфекциями, способность к антителообразованию на вакцинные антигены сохраняется. Известно, что интеркуррентные инфекции достоверно чаще развиваются у часто болеющих пациентов и пациентов с аллергическими заболеваниями (20,9%), чем у здоровых лиц [1].

Таким образом, действие иммуно­тропных препаратов бактериального происхождения направлено на активацию моноцитарно-макрофагальной системы в отношении элиминации чужеродных в антигенном отношении субстанций.

ОМ-85: механизм действия и клиническая эффективность

К известным и хорошо изученным иммуномодуляторам бактериального происхождения относится препарат OM-85 – лиофилизированный лизат восьми видов бактерий, наиболее часто вызывающих инфекции дыхательных путей: Streptococcus pneumoniae, St. pyogenes, St. viridans, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, K. ozaenea, Staphylococcus aureus, Moraxella catarrhalis [3]. Пероральный прием препарата приводит к контакту антигенов возбудителей с макрофагами, находящимися в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта. Запускается процесс «праймирования» лимфоцитов, заключающийся в их активации и пролиферации с последующей презентацией их лимфоцитам МАLТ-системы (мукозо-ассоциированная лимфоидная ткань) в пейеровых бляшках. Праймированные лимфоциты покидают пейерову бляшку по лимфатическим сосудам и попадают в брыжеечный лимфоузел, затем мигрируют в кровь, где происходит их дальнейшая дифференцировка. В результате появляются коммитированные клоны В-лимфоцитов, продуцирующие специфические антитела к антигенам возбудителей. Кроме того, миграция коммитированных В-лимфоцитов из пейеровых бляшек в другие лимфоидные органы (миндалины глоточного кольца, лимфоузлы бронхолегочного аппарата и урогенитального тракта) и их последующая дифференциация в плазмоциты приводят к продукции высокоаффинного секреторного иммуноглобулина (Ig) класса A и развитию эффективной местной иммунной защиты против возбудителей. Секреторный IgA высокоустойчив к протеазам, что делает возможным его функционирование в секретах слизистых оболочек. Он характеризуется неспособностью связывать компоненты комплемента, что ведет к отсутствию повреждающего действия комплекса «антиген – антитело» на слизистые оболочки. Секреторный IgA препятствует адгезии микроорганизмов, их токсинов и аллергенов на эпителии слизистых оболочек, тем самым предотвращает их проникновение во внутреннюю среду организма. Антиадгезивные свойства секреторного IgA лежат в основе его антибактериальных, антивирусных и антиаллергенных свойств. Таким образом, пероральный прием OM-85 сопровождается продукцией антигенспецифического антительного ответа и повышением неспецифической резистентности в системе местного мукозального иммунитета [7]. Кроме того, OM-85 эффективен в отношении активации СD16+-клеток, повышения функциональной активности макрофагов, выработки ряда цитокинов и медиаторов (интерлейкин (ИЛ) 6, ИЛ-8, ИЛ-2, интерферон (ИФН) гамма). На фоне применения препарата одновременно отмечались увеличение продукции ИФН-альфа, снижение уровней ИЛ-4, фактора некроза опухоли (ФНО) альфа. Повышение уровня IgG усиливало межклеточные взаимодействия макрофагов, натуральных киллеров (таблица). Эти сдвиги можно интерпретировать как переключение иммунного ответа с Th₂-типа на Th₁-тип [8].

Включение иммуномодулирующих препаратов бактериального происхождения в комплексную терапию соматических заболеваний, протекающих в сочетании с ВИН, позволило добиться высокого клинического эффекта при разных патологиях.

Одним из перспективных направлений терапии при аллергических заболеваниях, в том числе бронхиальной астме (БА), признано применение OM-85. Одним из наиболее значимых триггеров БА являются рецидивирующие респираторные инфекции. Они способствуют не только гиперпродукции IgE и развитию гиперреактивности бронхиального дерева, но и усилению сенсибилизации организма к неинфекционным аллергенам. При этом возбудитель респираторной инфекции становится причинно-значимым аллергеном [9]. БА – наиболее распространенное хроническое заболевание у взрослых и детей. У детей раннего возраста чаще встречается вирус-индуцированный фенотип астмы [4]. Респираторные вирусы (рино-, адено-, метапневмо-, респираторно-синцитиальный, гриппа, парагриппа и др.) у детей поражают эпителий дыхательных путей. Наиболее частыми провоцирующими факторами бронхообструктивного синдрома у детей раннего возраста и обострений БА становятся вирусные инфекции [9]. Клиническая эффективность OM-85 обусловлена не только предупреждением ОРИ, нередко выступающих в качестве триггеров обострения, но и нормализацией соотношения Th₁/Th₂. OM-85 стимулирует синтез ИЛ-12 и ИФН-гамма и одновременно тормозит образование ИЛ-10. Это создает предпосылки для индукции Th₁-типа иммунного ответа, что сопровождается угнетением продукции ИЛ-4, уменьшением синтеза IgE и хемотаксиса эозинофилов. В ряде случаев у пациентов с аллергической патологией формируются хронические очаги инфекции (хронический тонзиллит и пиелонефрит, синуситы), возникают дисбиотические изменения в составе микрофлоры кишечника. При иммунологическом обследовании выявляются признаки ВИН при использовании рутинных методов. При углубленном лабораторном обследовании, например в гемограмме, обнаруживают снижение содержания форменных элементов периферической крови, селективный дефицит IgA и IgG2, недостаток секреторного IgA, дисиммуноглобулинемию, уменьшение абсолютного количества B-лимфоцитов, незначительное (менее чем на 20%) снижение различных параметров иммунограммы (CD3, CD4, CD16), нарушение процессов интерферонообразования и ферментных систем на уровне клетки (снижение активности миелопероксидазы и повышение активности щелочной фосфатазы), сниженный фагоцитоз, уменьшение синтеза лизоцима, функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов, повышение уровня общего IgE [4].

Указанные клинические данные и результаты иммунологических исследований служат основанием для использования иммунотропных фармакологических средств в лечении пациентов с аллергическими заболеваниями. Иммунотропная активность иммуномодуляторов позволяет применять их для восстановления функций иммунной системы и обеспечения должной иммунной защиты организма. Терапия иммуномодуляторами способствует устранению острых и хронических очагов инфекции и уменьшению проявлений аллергического процесса [10]. В то же время иммуномодулирующая терапия не является этиотропной по своей направленности. По данным C.H. Razi и соавт., у детей с аллергическими заболеваниями при включении OM-85 в комплексную терапию отмечается снижение не только частоты эпизодов респираторных инфекций, но и проявлений бронхообструкции, что может быть полезным для профилактики обострений у пациентов с БА. Кроме того, OM-85 повышает функциональную активность альвеолярных макрофагов против инфекционных и опухолевых антигенов, NK-клеток, уменьшает выработку IgE. У детей с БА и частыми интеркуррентными острыми респираторными заболеваниями применение OM-85 способствует клиническому улучшению в 68% случаев. Более чем в два раза сокращается заболеваемость ОРИ с явлениями бронхообструкции в течение года. Уменьшаются количество тяжелых приступов удушья и годовая потребность ребенка в бронходилататорах. При этом наблюдаются увеличение уровня ИФН-гамма, снижение общего IgЕ и циркулирующих иммунных комплексов в крови [11].

Эффективность системных бактериальных лизатов в профилактике инфекций респираторного тракта

Как известно, ОРИ могут быть причиной хронических заболеваний ЛОР-органов и бронхолегочного аппарата, а также провоцировать частые и длительные обострения имеющейся патологии. Тактика ведения больных с такими заболеваниями сложна, поскольку частое и длительное применение антибиотиков формирует резистентные штаммы возбудителей инфекции дыхательных путей, что в свою очередь снижает клиническую эффективность последующей антибиотикотерапии, приводит к развитию грибковых осложнений, дисбактериоза. В последние годы для лечения и профилактики респираторных заболеваний часто используют бактериальные лизаты. Эффективность системных бактериальных иммуномодуляторов в профилактике ОРИ у часто болеющих детей доказана во многих исследованиях. Благодаря стимулированию специфического и неспецифического иммунного ответа применение OM-85 у детей с рекуррентными респираторными заболеваниями способствует снижению частоты острых респираторных заболеваний (ОРЗ), уменьшает вероятность бактериальных осложнений [8, 12]. В исследовании M.D. Sprenkle и соавт. у часто и длительно болеющих детей при назначении OM-85 в два-три раза уменьшалась частота ОРЗ, фарингитов, бронхитов [13]. По данным метаанализа, проведенного B. Del-Rio-Navarro и соавт., прием бактериальных иммуностимуляторов приводит к сокращению числа острых инфекций дыхательных путей и их осложнений у часто болеющих детей [14].

Кроме того, бактериальные иммуномодуляторы используются для профилактики и лечения заболеваний верхних дыхательных путей – ангины, тонзиллита, фарингита, ларингита, синусита и отита [15]. Колонизация носоглотки микробами определяет патогенез инфекционно-воспалительных заболеваний респираторного тракта и ЛОР-органов. Чаще встречаются грамположительные бактерии (St. pneumoniae – 7–35% случаев, St. pyogenes – 5–11%) и грамотрицательные (H. influenzae – 5–20% случаев, K. pneumoniae – 5%) [5].

Анализ этиологической структуры бактериальных инфекций респираторного тракта и ЛОР-органов позволяет сделать вывод, что данные пневмотропные возбудители наиболее значимы.

В ряде исследований продемонстрировано снижение количества обострений хронического фарингита и среднего отита в два раза при использовании OM-85 [8, 12]. На фоне его применения в целях профилактики рецидивов хронического бронхита снижаются частота и тяжесть рецидивов, уменьшаются случаи госпитализации в 1,43 раза, ее продолжительность – в 1,8 раза. У детей с хроническим риносинуситом снижаются частота рецидивов и тяжесть симптомов [13]. OM-85 назначают во время ОРИ или при обострении хронических заболеваний ЛОР-органов одновременно с антибиотиками, что потенцирует действие последних. Они могут быть полезны в лечении инфекции, резистентной к антибактериальным препаратам, особенно при высевании из зева и носоглотки двух и более бактериальных возбудителей [15, 16]. Микробная контаминация дыхательных путей нередко провоцирует и поддерживает обострения хронического бронхита и хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ). При этом развивается бактериальное воспаление, усиливается секреция мокроты, ухудшается легочная функция. Один из функциональных и безопасных подходов к профилактике рецидивирующих инфекций дыхательных путей и обострений ХОБЛ – активация адаптивного и врожденного иммунного ответа, что может быть достигнуто при использовании бактериальных механических лизатов, например OM-85. Препарат отличается высоким профилем безопасности. O. Zagólski и соавт. [17], сравнивая воздействие бактериальных лизатов и аутовакцин на потенциально патогенные микроорганизмы носоглотки, показали, что в случае колонизации дыхательного тракта H. influenzae бактериальные лизаты более эффективны, чем аутовакцины (р

Таким образом, OM-85 можно отнести к иммуномодулирующим препаратам с доказанной эффективностью и безопасностью как у взрослых, так и у детей [20–22].

Согласно метаанализу, достоверных различий в отношении побочных эффектов между группой иммуномодуляторов микробного происхождения и группой плацебо не зафиксировано. Отмечается хорошая переносимость бактериальных лизатов [14].

OM-85 имеет простой и удобный режим дозирования, выпускается в дозах 7 и 3,5 мг. Детям с шести месяцев до 12 лет препарат назначают в капсулах по 3,5 мг, при необходимости капсулу можно открыть и ее содержимое растворить в соке или воде.

Повторные курсы иммунотропной терапии препаратами бактериального происхождения обычно проводят не чаще одного-двух раз в год, в весенне-осенний период. Эффект одного курса сохраняется в течение шести месяцев.

Клинический случай

Пациентка А. (38 лет) впервые в августе 2015 г. обратилась к специалисту по поводу эпизодических приступов удушья, приступообразного сухого кашля, заложенности носа с отделяемым желтого цвета, общей слабости, быстрой утомляемости, частых простудных заболеваний. Из анамнеза: последние 15 лет имеют место чихание, ринорея, реже кашель при контакте с домашней пылью, в период цветения растений (июнь – июль). Приступы удушья впервые отмечались пять лет назад, в период цветения. Затем в течение года участились. В 2010 г. диагностирована бронхиальная астма, атопическая форма легкого течения. Назначена терапия ингаляционными глюкокортикостероидами (будесонид 200 мкг/доза по два вдоха два раза в день), Вентолин – ситуационно. Рекомендации ЛОР-врача: мометазона фуроат 50 мкг/доза по две инсуффляции утром до одного месяца курсами. В течение последних двух лет беспокоят частые ОРИ – до пяти-шести раз в год, осложняющиеся острым синуситом, тонзиллитом или бронхитом. За последний год применялось до пяти курсов лечения антибактериальными препаратами разных групп, назначаемыми как врачом, так и самостоятельно. С конца мая 2015 г. – ежедневные приступы затрудненного дыхания, постоянная заложенность носа, потливость, кратковременная субфебрильная температура тела. Лечение получала в поликлинике по месту жительства (будесонид/формотерол 4,5/160 мкг/доза по одному вдоху два раза в день, Амоксиклав 1000 мг три раза в день перорально семь дней, ингаляции Беродуала через небулайзер, спрей в нос мометазона фуроат по схеме два месяца). На фоне терапии: приступы удушья редкие (до одного раза в две недели, купируемые в основном самостоятельно), сохранялись сухой кашель утром, заложенность носа, быстрая утомляемость, потливость.

При осмотре: состояние удовлетворительное. Кожа и слизистые оболочки чистые, нормальной окраски. Отеков нет. Рост – 172 см, вес – 81 кг. Носовое дыхание затруднено с обеих сторон. Дыхание жесткое, выслушиваются хрипы на форсированном выдохе. Частота дыхательных движений (ЧДД) – 16 в минуту. Тоны сердца: ясные, ритм правильный. Частота сердечных сокращений (ЧСС) – 68 в минуту. Артериальное давление (АД) – 95/75 мм рт. ст. Язык влажный, обложен белым налетом. Живот в акте дыхания участвует, при пальпации мягкий, безболезненный. Печень не увеличена, область пальпации безболезненная. Стул однократный, оформленный. Симптом «поколачивания» отрицательный. Мочеиспускание свободное, безболезненное.

Результаты обследования от 14 августа 2015 г.

Общий анализ крови: гемоглобин 144,0 г/л (норма 120–140), гематокрит 43,2% (36–42), эритроциты 4,49 × 10¹²/л (3,90–4,70), средний объем эритроцита 96,2 фл (80–100), средний уровень гемоглобина 32,1 пг (27–31), средняя концентрация гемоглобина в эритроците 333,0 г/л (320–380), коэффициент анизотропии эритроцитов 13,0% (0–14,5), цветовой показатель (ЦП) 0,96 Ед (0,85–1,05), тромбоциты 185,0 × 10⁹/л (180–320), средний объем тромбоцита 8,2 фл (7,6–10,8), лейкоциты 3,40 × 10⁹/л (4–9), лимфоциты 18,4% (19–37), нейтрофилы 5,1 × 10⁹/л (2,00–7,5), моноциты 0,70 × 10⁹/л (0,3–1,1), эозинофилы 11% (1,00–5,00), базофилы 0,08 × 10⁹/л (0,08), скорость оседания эритроцитов (СОЭ) 15 мм/ч (2–15).

Общий анализ мочи: цвет желтый (янтарно-желтый/соломенно-желтый), прозрачная, рН слабо-кислая 6,5 (5,0–7,0), плотность 1018 г/л (1004–1030), белок 0,1 г/л, глюкоза 0 ммоль/л (0–1,7), кетоны – нет (отрицательно), эритроциты 0 кл/мкл (0–26), эпителий плоский 3 кл/мкл (0–39), эпителий переходный 0 кл/мкл (0–6), цилиндры 0 кл/мкл (0–2), цилиндры патологические 0 кл/мкл (0–1), лейкоциты 1 кл/мкл (0–35), слизь 26 кл/мкл (0–79), дрожжеподобные клетки 0 кл/мкл (0–0,02), бактерии 0 кл/мкл (0–60), кристаллы 0 кл/мкл (0–3).

Биохимический анализ крови: глюкоза 5,36 ммоль/л (4,10–6,10), общий белок 76,3 г/л (66–83), билирубин общий 18,6 мкмоль/л (5–21), аспартатаминотрансфераза 20,0 Ед/л (0–38), аланинаминотрансфераза 16,4 Ед/л (0–38).

Иммунологические показатели крови: IgE общий 32,5 МЕ/мл (0,0–130,0), IgA 83,5 мг/дл (70–350), IgM 104,6 мг/дл (50–250), IgG 876 мг/дл (750–1800). CD3+ 62,9% (55–88), CD3+CD8+ 31% (19–37), иммунорегуляторный индекс CD4/CD8+ 1,3 (1–2,5), CD19+ 7,4% (5–19), ИФН-гамма 8 Ед/мл, НСТ (нитросиний тетразолий)-тест 6% (6–12).

Электрокардиограмма: ритм синусовый с ЧСС 82 в минуту. Электрическая ось сердца (ЭОС) – вертикальное направление.

Спирометрия (с пробой сальбутамолом 200 мкг): жизненная емкость легких (ЖЕЛ) 92,7%, объем форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ₁) 89,6%, индекс Тиффно 89,0%, МОС₂₅ (мгновенная объемная скорость после выдоха) 84,6%, МОС₅₀ 87,3%, МОС₇₅ 85,1%. После ингаляции сальбутамола: ЖЕЛ 95,7%, ОФВ₁ 90,6%, индекс Тиффно 89,4%, МОС₂₅ 87,4%, МОС₅₀ 90,3%, МОС₇₅ 89,2%.

Рентгенография придаточных пазух носа: утолщение стенок носовых пазух. Проведены кожные скарификационные тесты с основными ингаляционными аллергенами: тест-контроль отрицательный, гистамин 8 × 8 мм, домашняя пыль 12 × 14 мм, библиотечная пыль 23 × 13 мм, Dermatophagoides pteronyssinus 14 × 13 мм, перо подушки 10 × 11 мм, шерсть кошки 3 × 4 мм, смесь деревьев 2 х 1 мм, смесь злаковых трав 15 × 14 мм, смесь сорных трав 2 × 2 мм.

Пациентке выставлен диагноз: бронхиальная астма, атопическая форма, персистирующее течение средней степени, контролируемая. Назначена терапия: будесонид/формотерол 4,5/160 мкг/доза по одному вдоху два раза в сутки, мометазона фуроат по две инсуффляции в каждый носовой ход один раз в сутки три месяца, OM-85 7 мг по стандартной схеме с 17 по 26 августа, с 16 по 25 сентября, с 16 по 26 октября 2015 г. по одной таблетке в сутки. Через пять месяцев курс ОМ-85 7 мг по указанной схеме повторен (с 21 по 30 марта, с 20 по 29 апреля, с 20 по 29 мая 2016 г.).

Повторные осмотр и обследование через девять месяцев – 31 мая 2016 г. Значительное улучшение состояния пациентки (в период пыления растений редкие симптомы БА, сохранялись приступообразный кашель и заложенность носа в июне – июле, за период наблюдения два эпизода ОРИ, слабости нет, эпизодическая утомляемость).

Общий анализ крови: гемоглобин 140 г/л (120–140), гематокрит 42,0% (36–42), эритроциты 4,31 × 10¹²/л (3,9–4,7), средний объем эритроцита 97,0 фл (80–100), среднее содержание гемоглобина 32,0 пг (27–31), средняя концентрация гемоглобина в эритроците 344,0 г/л (300–380), коэффициент анизотропии эритроцитов 12,3% (0–14,5), ЦП 0,97 Ед (0,85–1,05), тромбоциты 193 × 10⁹/л (180–320), средний объем тромбоцита 9,6 фл (7,4–10,4), лейкоциты 4,1 × 10⁹/л (4–9), лимфоциты 1,9 × 10⁹/л (1,2–3,0), лимфоциты 21,4% (19–37), моноциты 3,50% (3–11), нейтрофилы 7,1 × 10⁹/л (2,00–7,5), моноциты 0,60 × 10⁹/л (0,3–1,1), эозинофилы 8% (1,00–5,00), СОЭ 8 мм/ч (2–15).

Общий анализ мочи: показатели в пределах нормы.

Биохимический анализ крови: показатели в пределах нормы.

Иммунологические показатели: IgE общий 438 МЕ/мл (0,0–130,0), IgA 114,9 мг/дл (70–350), IgM 102,6 мг/дл (50–250), IgG 921 мг/дл (750–1800). CD3+ 61,4% (55–88), CD3+CD8+ 28% (19–37), иммунорегуляторный индекс CD4/CD8+ 1,5 (1–2,5), CD19+ 7,9% (5–19), ИФН-гамма 16 Ед/мл, НСТ-тест 7 (6–12).

Спирометрия (с пробой сальбутамолом 200 мкг): ЖЕЛ 91,5%, ОФВ₁ 90,3%, индекс Тиффно 89,7%, МОС₂₅ 85,2%, МОС₅₀ 86,8%, МОС₇₅ 87,1%. После ингаляции сальбутамола: ЖЕЛ 93,0%, ОФВ₁ 91,1%, индекс Тиффно 88,4%, МОС₂₅ 87,4%, МОС₅₀ 91,3%, МОС₇₅ 90,2%.

Диагноз тот же, базисное лечение БА, ринита продолжено. В декабре 2016 г. начат первый курс аллергенспецифической иммунотерапии (АСИТ) с пыльцой злаковых трав.

Как видим, на фоне лечения OM-85 (два курса в течение года) улучшилось общее самочувствие (уменьшились слабость, утомляемость, частота симптомов БА, восстановилась физическая работоспособность пациентки). Эффективность препарата проявилась и в снижении частоты и длительности течения острых респираторных инфекций. Через девять месяцев в контрольных анализах крови в динамике регистрировалось незначительное снижение уровней IgM, IgE при повышении уровней IgА и IgG в сыворотке, повышение уровня ИФН-гамма. Кроме того, у пациентки отмечалось снижение численности клеточных популяций с маркерами CD3, являющихся показателями активности Th₂-иммунного ответа. С учетом положительной динамики течения заболевания и достижения контроля БА пациентке начат первый курс АСИТ.

Заключение

Бактериальные лизаты – иммуномодуляторы с доказанной эффективностью. Их применение обоснованно даже при аллергических заболеваниях, когда целями иммунотерапии являются снижение выраженности воспалительной реакции и улучшение клинической картины основного заболевания, а при наличии хронического очага инфекции – его ликвидация.

Включение иммуномодуляторов микробного происхождения в комплексную терапию респираторных инфекций позволяет обеспечить локализацию очагов инфекции, снизить риск развития осложнений, а также потребность в антибактериальных и противовоспалительных препаратах.

Бактериальные лизаты в лечении и профилактике респираторных заболеваний у детей

В структуре общей заболеваемости детей острые респираторные заболевания (ОРЗ) составляют 50– 60 % [1]. Хотя в 90 % случаев ОРЗ вызывают респираторные вирусы и вирус гриппа, более чем половине детей в связи с опасением активации бактериальной флоры на фоне вирусного заболевания назначаются антибиотики [2]. Повсеместная озабоченность излишним использованием антибактериальных препаратов при вирусных ОРЗ (ОРВИ) связана с рядом конкретных опасностей: возможностью побочного действия антибиотиков, распространением устойчивых штаммов пневмотропных бактерий и, кроме того, излишними расходами на лечение.

Основные усилия педиатров должны быть направлены на оптимизацию терапевтической активности, в частности на снижение неоправданного назначения антибактериальных средств. Бактериальные ОРЗ у детей, как и у взрослых, относительно немногочисленны, но именно они представляют наибольшую угрозу развития серьезных осложнений. Бактериальные ОРЗ вызываются относительно небольшим числом возбудителей, в основном вегетирующих в верхних дыхательных путях. Это пневмококки, гемолитический стрептококк группы А, бескапсульная гемофильная палочка (H.influenzae).

Дети грудного и раннего возраста не могут не болеть ОРЗ, однако важно, чтобы они возникали не слишком часто и протекали не тяжело. Высокая восприимчивость к возбудителям ОРЗ обусловлена прежде всего незрелостью системы иммунитета и малым числом предыдущих контактов с вирусами. У детей раннего возраста отмечается довольно низкий уровень образования интерферонов и их активности, что ослабляет противовирусную защиту. Фагоцитоз у ребенка первых лет жизни носит незавершенный характер, несмотря на его высокую активность. Помимо этого, кожа и слизистые ребенка рыхлые и тонкие, что снижает их барьерные свойства и облегчает адгезию и проникновение возбудителя.

Созревание специфической иммунной защиты, Т- и В-лимфоцитов происходит у ребенка вплоть до периода полового созревания. К 6–9 месяцам жизни ребенка полностью элиминируются иммуноглобулины (Ig) (преимущественно класса G), полученные им от матери. Синтез же собственных иммуноглобулинов G достигнет уровня взрослого только к 6–8 годам. Уровень иммуноглобулинов А, осуществляющих местную защиту слизистых, у новорожденных и детей раннего возраста низок и достигает уровня взрослого  10–12 годам, что обусловливает более высокую восприимчивость ребенка к респираторным инфекциям.

При учете всех этих факторов становится понятным, почему неблагоприятное течение беременности, недоношенность, внутриутробное инфицирование, искусственное вскармливание и другие факторы значительно повышают риск развития ОРВИ.

Носительство условно-патогенной бактериальной флоры дыхательных путей является резервуаром инфекции, особенно в межэпидемическом периоде. С возрастом появляются антитела к большему числу инфектов, что и сопровождается снижением заболеваемости. Поэтому частые ОРЗ нельзя считать признаком иммунодефицита — они отражают чаще всего высокий уровень контактов с источниками инфекции. В условиях детского коллектива формируется групповой иммунитет к ряду возбудителей, на что указывает высокий процент носительства при отсутствии заболеваний.

Вместе с тем в случаях частой респираторной заболеваемости детей, развития у них тяжелых осложнений нередко выявляются признаки иммунного дисбаланса, что требует проведения иммунокоррекции — целенаправленной и обоснованной. Необходимо обратить внимание на то, что путь антигена и антител после системной и местной иммунизации существенно отличается. При парентеральной иммунизации вырабатываются главным образом антитела классов IgM и IgG, они сконцентрированы в селезенке и периферических лимфатических узлах и поступают в кровоток. Но они не могут влиять на антигены возбудителя, колонизировавшего слизистую оболочку, так как не способны проникнуть на ее поверхность. Поэтому особое значение в этом случае приобретает местный иммунитет — нанесение антигена на поверхность слизистой оболочки приводит к развитию местного иммунного ответа и выработке секреторных иммуноглобулинов класса IgA. Особую роль приобретает в этом отношении обеспечение мукозального иммунитета лимфоидно-глоточного кольца, обусловливающее оптимальную защиту верхних дыхательных путей.

Несмотря на то что в основе многих инфекций верхних дыхательных путей, как правило, лежит вирусная инфекция, они часто осложняются развитием бактериальной суперинфекции экзогенного или эндогенного происхождения. В ротоглотке у часто и длительно болеющих пациентов выявляются возбудители: Str.pneumoniae (25–30 %), H.influenzae (15–20 %), M.catarrhalis (15–20 %), Str.pyogenes (2– 3 %), представители грамотрицательной микрофлоры, персистенция различных вирусов. В связи с этим особую актуальность приобретают иммуномодуляторы микробного происхождения. Это послужило основанием для разработки и использования бактериальных лизатов с целью увеличения продукции специфических антител, а также стимуляции неспецифических факторов защиты. Были созданы различные препараты системного (Бронхомунал, рибомунил) и местного (ИРС 19, имудон) действия. Существует несколько их типов:

— препараты на основе компонентов клеточной стенки бактерий;

— препараты на основе нуклеиновых кислот;

— бактериальные лизаты.

Механизмы действия и эффекты системных и топических иммунотропных средств различны. Данные экспериментальных работ свидетельствуют, что в ряде случаев недостаточное воздействие местных иммуномодуляторов может быть связано со следующими причинами: коротким временем контакта препаратов со слизистыми оболочками, захватом слизистыми оболочками незначительной части антигенных субстанций в силу недостаточного времени воздействия; постоянное омывание слюной области ротоглоточного сегмента, где не функционирует реснитчатый эпителий и нет постоянного контакта препарата с клетками. Такие же результаты были получены в отношении местной терапии антибиотиками, которые подтверждают эффективность использования антибиотиков для местной терапии только при лечении отитов. Потому в клинической практике наибольшее распространение получили бактериальные лизаты системного действия, в частности, хороший эффект получен при применении Бронхомунала.

Бактериальные лизаты обладают рядом специфических свойств, благодаря которым эффективность их применения оказывается намного выше. Механизм действия бактериальных лизатов — стимуляция процессов фагоцитоза и презентации антигена, усиление продукции противовоспалительных цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-10, ТРФ), развитие адъювантного эффекта. Следует особо подчеркнуть их влияние на всех стадиях иммунного ответа. Этот механизм оказывается самым физиологичным, так как бактериальные лизаты стимулируют собственные реакции организма на воздействие антигена и не вызывают ненужных дополнительных эффектов.

Нередко бактериальные лизаты называют бактериальными вакцинами, представляющими собой лизаты пневмотропных и ряда других бактерий. Среди них наиболее широко используются Бронхомунал, ИРС 19, имудон, рибомунил. Они пришли на смену таким стимуляторам, как пирогенал и продигиозан. В инструкциях к бактериальным вакцинам указывается, что они стимулируют неспецифический иммунитет наряду с продукцией специфических антител к входящим в препараты возбудителям. Более конкретно говорится о стимуляции продукции секреторных IgA, интерлейкина-1 и a-интерферона.

Эффективность использования иммунотерапии с помощью бактериальных лизатов подтверждена в клинических исследованиях. Многочисленными работами показано, что применение этих препаратов ведет к снижению частоты ОРВИ и их осложнений, уменьшению тяжести их течения.

Препараты, содержащие лизаты бактерий, в последние годы привлекают интерес многих специалистов, так как их основное применение связано прежде всего с лечением и профилактикой инфекций носоглотки и респираторного тракта. Учитывая иммунотропный эффект и отсутствие формирования стойкого протективного иммунитета, более правильно называть эту группу лекарственных средств бактериальными иммуномодуляторами. Бактериальные лизаты можно назначать в острый период заболевания и с профилактической целью. В острый период респираторных инфекций назначение препаратов более эффективно в сочетании с этиотропной терапией. По нашим данным, у часто болеющих детей с острыми респираторными инфекциями использование Бронхомунала в сочетании с антибактериальной терапией более эффективно при высевании из зева и носоглотки двух и более бактериальных возбудителей в высокой концентрации [3–5].

Использование бактериальных лизатов наиболее оправданно с целью увеличения продукции специфических антител, а также стимуляции неспецифических факторов защиты (секреторных IgA, цитокинов, NK-клеток, клеток макрофагально-фагоцитарной системы и др.). В педиатрической практике наибольшее распространение получили бактериальные лизаты системного действия.

Бронхомунал (Lek, Словения), в течение десяти лет используемый в нашей клинике, представляет собой бактериальный лизат системного действия, активно воздействующий на неспецифические и специфические звенья иммунного ответа как системного, так и местного — в верхних и нижних дыхательных путях.

Бронхомунал инициирует специфический иммунный ответ на бактериальные антигены, присутствующие в препарате.

Бронхомунал содержит 7 лиофилизированных лизатов наиболее частых бактериальных возбудителей респираторных заболеваний (Str.pneumoniаe, Hemophillus influenzae, Klebsiella pneumoniаe, ozlanae, Staph.aureus, Str.viridans, Str.pyogenes, Moxarella catarrhalis).

Анализируя действие препаратов микробного происхождения, содержащих липополисахариды грам­отрицательных бактерий и мембранные фракции, следует отметить, что основной механизм их действия связан с активирующим влиянием на функциональный статус макрофагов. Данные препараты стимулируют фагоцитоз и через него могут влиять на иммунокомпетентные клетки.

При применении лизатов системного действия (Бронхомунал) антигенстимулированные клетки с поверхностным иммуноглобулином A попадают с циркулирующей кровью в лимфоидные органы. Развитие специфического иммунного ответа происходит при кооперации Т- и В-лимфоцитов, макрофагов или дендритных клеток. В дальнейшем специфический иммуноглобулин A вновь транспортируется на поверхность слизистых, препятствуя инвазии инфекционных агентов, их адсорбции, фагоцитозу и формированию иммунных комплексов. С другой стороны, активация цитотоксических Т-лимфоцитов приводит к уничтожению инфицированных клеток.

Кроме того, по современным представлениям, глоточная и небные миндалины рассматриваются не как самостоятельная анатомическая единица, а как часть MALT-системы (Mucosa-associated lymphoid tissue) или, в более широком смысле, часть иммунной системы. Использование бактериальных лизатов или бактериальных рибосом обусловливает контакт антигенов с макрофагами MALT-системы миндалин, респираторного и желудочно-кишечного трактов, с последующей их презентацией лимфоцитам. В результате этого появляются коммитированные клоны В-лимфоцитов, продуцирующие специфические антитела к возбудителям, антигены которых содержатся в препарате. Миграция коммитированных В-лимфоцитов в другие лимфоидные образования MALT-системы и последующая их дифференциация в плазмоциты приводят к продукции специфического секреторного IgA и развитию эффективной местной иммунной защиты против основных возбудителей острых респираторных заболеваний. Так, использование Бронхомунала обеспечивает уменьшение частоты носительства патогенной и условно-патогенной флоры, степени контаминации ею миндалин более чем на 50 % [6].

Таким образом, прием бактериальных иммунотропных препаратов имеет вакциноподобное действие, сопровождающееся индукцией специфического иммунного ответа как местного, так и системного. Теснейшее взаимодействие иммунных образований лимфоглоточного кольца дыхательных путей с подобными структурами ЖКТ (пейеровы бляшки, аппендикс и т.д.) дает возможность выбирать различные варианты вакцинотерапии — системную (в том числе Бронхомунал) или топическую.

Многочисленные исследования свидетельствуют, что применение Бронхомунала у часто болеющих детей ведет к снижению частоты ОРЗ, снижает вероятность бактериальных осложнений. Клинический эффект Бронхомунала заключается в снижении количества обострений хронического фарингита и среднего отита в 2 раза [7]. Иммунологические исследования свидетельствуют, что очевидным противоинфекционным эффектом Бронхомунала является, помимо увеличения уровня специфических антител, нарастание уровней IgA как в сыворотке крови, так и в секрете дыхательных путей. IgA фиксируется на слизистых, поддерживает их барьерную функцию, взаимодействует со специфическими антигенами бактерий. Препарат улучшает показатели гуморального и клеточного иммунитета через пейеровы бляшки в слизистой оболочке кишечника, стимулирует перитонеальные макрофаги. При его применении в сыворотке крови повышается количество Т-лимфоцитов, IgA, IgG, IgМ.

Бронхомунал также вызывает активацию СD16+-клеток, повышение функциональной активности макрофагов, выработку ряда цитокинов и медиаторов (ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-2, g-ИФН). Одновременно происходит увеличение продукции a-интерферона, снижение уровней ИЛ-4, ФНО-a. Повышение уровня IgG усиливает межклеточные взаимодействия макрофагов, натуральных киллеров. Эти сдвиги можно интерпретировать как переключение иммунного ответа Th3-типа на Th2-тип. Как показали клинические наблюдения, дети с аллергией при включении им Бронхомунала в комплексную терапию не только реже болеют ОРВИ, но и в меньшей степени подвержены приступам бронхообструкции.

Согласно данным С.В. Зайкова [8], Бронхомунал, кроме того, повышает функциональную активность альвеолярных макрофагов против инфекционных и опухолевых антигенов, NK-клеток «естественных, натуральных киллеров», уменьшает выработку IgE.

Препарат применяют как для лечения острого респираторного заболевания, так и с профилактической целью по 1 капсуле 1 раз в день. При остром периоде заболевания курс лечения длится от 10 до 30 дней, профилактический курс — 10 дней в месяц в течение 3 месяцев. В педиатрической практике используют Бронхомунал П, в котором содержится половинная взрослая доза бактериального лизата (0,0035 г). Назначение Бронхомунала в остром периоде более эффективно в сочетании с этиотропными средствами.

Способность очищенных бактериальных лизатов повышать не только специфический иммунный ответ, но и активизировать неспецифическую защиту позволяет их успешно применять в группе детей, у которых нередко вирусно-бактериальный синергизм приводит к затяжному рецидивирующему течению с чередованием инфекций верхних и нижних дыхательных путей и среднего уха. Ранняя иммунизация против основных патогенов с помощью Бронхомунала снижает процент внутричерепных осложнений со стороны околоносовых пазух и уха у детей раннего возраста.

У детей с бронхиальной астмой и частыми интеркуррентными острыми респираторными заболеваниями применение Бронхомунала способствует клиническому улучшению в 68 % наблюдений. Более чем в 2 раза сокращается заболеваемость острыми респираторными инфекциями с явлениями бронхообструкции в течение года. Уменьшается количество тяжелых приступов удушья и годовая потребность ребенка в бронходилататорах. При этом наблюдается увеличение уровня интерферона гамма, снижение общего иммуноглобулина Е и циркулирующих иммунных комплексов в крови [9].

Применение Бронхомунала для профилактики рецидивов хронического бронхита снижает частоту и тяжесть рецидивов, уменьшает случаи госпитализации в 1,43 раза, ее продолжительность — в 1,8 раза. У детей с хроническим риносинуситом отмечено снижение частоты рецидивов и тяжести симптомов [10]. У часто и длительно болеющих (ЧДБ) детей при назначении Бронхомунала в 2–3 раза снижается частота ОРЗ, фарингитов, бронхитов [11].

Эффект иммуномодуляторов системного действия (Бронхомунал) сохраняется в течение 6 месяцев, что важно для определения интервала между курсами. У ЧДБ детей в течение года показано проведение двух трехмесячных курса по 10 дней каждый месяц.

Таким образом, механизм действия Бронхомунала складывается из неспецифического и специфического действия. Неспецифическое действие связано с активацией клеточного иммунитета (CD3+, CD4+, CD3+HLA-DR+, CD3+-CD16, CD3-CD16+-клетки, повышением функциональной активности макрофагов) и выработкой ряда цитокинов и медиаторов (ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-2, TNF-a, NAF, гамма-ИФН). К специфическому действию можно отнести увеличение синтеза IgА, который фиксируется на слизистых, поддерживает их барьерную функцию, взаимодействует за счет SIgA со специфическими АГ бактерий. В связи с этим Бронхомунал является не только иммуностимулятором, но в не меньшей степени обладает иммуномодулирующим, вакцинирующим и системным действием. Препарат, кроме антигенспецифического иммунного ответа, вызывает активацию многих неспецифических защитных функций [12].

Клинический эффект профилактического применения Бронхомунала П у ЧДБ детей, как по нашим данным, так и по материалам многоцентрового исследования [11], определяется 3–5-кратным уменьшением числа эпизодов респираторных заболеваний, суммарная длительность которых сокращается более чем в 6 раз, а антибактериальная нагрузка уменьшается в 10 раз.

Bibliography

1. Мизерницкий Ю.Л., Мельникова И.М., Марушков В.И. Иммунокоррекция в комплексной терапии респираторных заболеваний // Сonsilium Medicum. Пульмонология (приложение). — 2005. — Т. 7, № 16.

2. Кубылинская И.А. Фармакотерапия: Применение Бронхо-Ваксома в профилактике и лечении острых и хронических заболеваний ЛОР-органов у детей // Конспект. — 2006. — № 15(420).

3. Юлиш Е.И., Колесникова А.Г., Кривущев Б.И. Иммунный статус детей, перенесших внутриутробное и (или) интранатальное поражение центральной нервной системы // Акт. питання фармац. та мед. науки та практ. — Запоріжжя, 1999. — С. 226-229.

4. Юлиш Е.И., Колесникова А.Г., Кривущев Б.И. Значение клинико-иммунологических критериев в профилактике нарушений у часто и длительно болеющих детей с перинатальной энцефалопатией, родившихся в неблагоприятной экологической зоне // Вестник гигиены и эпидемиологии. — 2000. — Т. 4, № 1. — С. 117-120.

5. Кривущев Б.И., Юлиш Е.И. Методы реабилитации часто болеющих детей, перенесших перинатальное поражение центральной нервной системы // Здоровье ребенка. — 2009. — № 1(16). — С. 25-28.

6. Крюков А.И., Лучшева Ю.В., Баландин А.В. и др. Рациональная антибиотикотерапия при ангине и хроническом тонзиллите // Consilium Medicum. — 2005. — Т. 7, № 4. — С. 297-300.

7. Богомильский М.Р. Значение бактериальной иммунокоррекции в лечении болезней уха, горла и носа у детей // Трудный пациент. — 2007. — 10. — С. 26-32.

8. Зайков С.В. Перспективы применения бактериальных лизатов при заболеваниях органов дыхания // Український пульмонологичній журнал. — 2009. — 3. — С. 64-68.

9. Малкоч А.В., Анастасевич Л.А., Боткина А.С. Острые респираторные заболевания и возможности иммуномодулирующей терапии // Лечащий врач. — 2008. — 5. — С. 16-23.

10. Маркова Т.П. Иммунотропные препараты в клинической практике // Практическое руководство по клинической иммунологии и аллергологии / Под ред. Р.М. Хаитова. — М., 2003. — С. 31-45.

11. Гаращенко Т.И., Богомильский М.Р., Маркова Т.П. Бактериальные иммунокорректоры в профилактике заболеваний верхних дыхательных путей и уха у часто болеющих детей // Consilium Medicum. Педиатрия (приложение). — 2002. — Т. 4, № 3. — С. 7-14.

12. Сенцова Т.Б. Современные иммуномодуляторы // Consilium Мedicum. — 2004. — № 3.

Бактериальные лизаты. Бронхо–Ваксом | Маркова Т.П., Чувиров Д.Г.

В структуре общей заболеваемости у детей респираторные заболевания составляют 50%, а у взрослых более 30%, преобладают острые респираторные инфекции [9]. Проблема является чрезвычайно актуальной из–за возможности развития в дальнейшем хронических неспецифических заболеваний легких, высока социальная значимость проблемы респираторных инфекций для детского возраста в связи с влиянием на формирование ребенка.

Препараты, содержащие лизаты бактерий, в последние годы привлекают интерес многих специалистов, их основное применение связано прежде всего с профилактикой инфекций носоглотки и респираторного тракта. Учитывая иммунотропный эффект и отсутствие формирования стойкого протективного иммунитета, более правильно называть эту группу лекарственных средств бактериальными иммуномодуляторами. На основании состава и оценки особенностей механизма действия их можно разделить на группы.
Бактериальные иммуномодуляторы:
I. Лизаты микроорганизмов – cинтетические препараты:
Бронхо–Ваксом
Бронхо–мунал
Рибомунил
ВП–4 (вакцина поликомпонентная)
Биостим
ИРС–19
Имудон
Солкоуровак
Рузам
Солкотриховак
Сальмозан
Продигиозан
Пирогенал
Иммуфорс
II Системного действия:
Бронхо–Ваксом
Бронхо–мунал
Рибомунил (таблетированная форма)
Биостим
ВП–4
Ликопид (таблетированная форма 10 мг)
Рузам
Иммуфорс
III Преимущественно топического действия:
ИРС–19
Имудон
Ликопид (таблетированная форма 1мг)
Многие препараты (продигиозан, пирогенал, сальмозан) имеют лишь историческое значение и в настоящее время не применяются.
 Среди новых бактериальных лизатов в стадии клинических испытаний находится препарат иммуфорс, который содержит липополисахарид Shigella sonnei, обладает низкой пирогенностью и токсичностью, направленно действует на макрофагальное звено иммунной системы, стимулирует цитотоксическую и антиген презентирующую активность макрофагов. Под влиянием иммуфорса усиливается синтез таких цитокинов, как g–интерферон (ИФН), фактор некроза опухоли–a (ФНО), интерлейкина–6 (ИЛ–6). Влияние на функциональную активность макрофагов особенно четко проявляется при изначальном снижении данного показателя.
Бронхо–Ваксом (фармацевтическая компания «ОМ PHARMA», Швейцария) включает лиофилизированные экстракты 8 возбудителей: Haemophilus influenzae, Diplococcus pneumonia, Streptococcus viridans, Streptococcus pyogens, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaena, Staphylococcus aureus, Neisseria (Branhamella) catarrhalis.
Бронхо–Ваксом разрешен к применению с 6 месяцев и выпускается в дозировке 7 мг и 3,5 мг. Препарат обычно хорошо переносится, частота слабовыраженных побочных реакций составляет 3–4%. У детей капсулу при необходимости можно открыть и растворить содержимое в соке или воде. Побочные реакции проявляются в виде желудочно–кишечных расстройств (тошнота, боль в животе, рвоте), кожных реакций (включая эритему и зуд), нарушений дыхательной системы (кашель, одышка), а также голодной боли, чувства усталости. В случае продолжающихся желудочно–кишечных расстройств, кожных реакций и респираторных проявлений лечение необходимо прекратить.
Схема назначения Бронхо–Ваксома: у взрослых и детей старше 12 лет по капсуле 7мг, утром натощак 10 дней в месяц – 3 месяца. У детей с 6 месяцев до 12 лет препарат назначают в капсулах по 3,5 мг.
Бронхо–Ваксом стимулирует секрецию простагландина Е2 и ИЛ–1 альвеолярными макрофагами, повышает активность макрофагов против инфекционных агентов и клеток опухоли, усиливает секрецию aФНО и ИЛ–2, активирует естественные киллеры (ЕК–клетки), усиливают синтез IgA, ИЛ–8, aФНО, нейтрофил–активирующего фактора (NAF) [14,16]. Препарат стимулирует В–клетки, повышает уровень IgA, секреторного IgA на слизистых, в слюне, бронхоальвеолярной лаважной жидкости, повышает функциональную и метаболическую активность макрофагов, включая альвеолярные макрофаги [14,16,18].
 Бактериальные лизаты можно назначать в острый период заболевания и с профилактической целью. В острый период респираторных инфекций назначение препаратов более эффективно в сочетании с этиотропной терапией. При острых респираторных вирусных инфекциях (ОРВИ) воспаление локализуется в различных отделах верхних дыхательных путей, что может приводить к развитию ринофарингита, фаринго–ларингита, ларинго–трахео–бронхита и т.д. Предрасполагающим моментом является снижение местного иммунитета. При наблюдении 45 больных острым фарингитом или с обострением хронического фарингита в возрасте от 19 до 65 лет, 15 из них получали Бронхо–Ваксом в виде монотерапии по 1 капсуле в течение 10 дней. 15 больных получали Бронхо–Ваксом в сочетании с местным назначением Повидон йода (антисептическое и дезинфицирующее средство). 15 больных получали местно Повидон йод. Наилучший эффект был получен у больных острым фарингитом, получавших сочетанную терапию Бронхо–Ваксомом и Повидон–йодом [10].
25–50% детей с респираторными инфекциями получают различные антибиотики, так как педиатры боятся пропустить активацию бактериальной флоры после вирусной инфекции [3]. По нашим данным, у часто болеющих детей с острыми респираторными инфекциями назначение бактериальных лизатов в сочетании с антибактериальной терапией более эффективно при высевании из зева и носоглотки двух и более бактериальных возбудителей.
При назначении Бронхо–Ваксома в остром периоде респираторных инфекций детям в течение 10 дней в сочетании с антибиотиками отмечена эффективность комплексного применения и снижение потребности в других лекарственных средствах и антибиотиках [2].
По нашим данным при назначении бактериальных лизатов системного действия в группе часто и длительно болеющих детей (ЧБД) с очагами хронической инфекции (хронический тонзиллит, хронический фарингит, аденоидиты) и частотой ОРЗ 6 и более раз в год, вне периода обострения, отмечается активация Т–клеток (CD3+HLA–DR+–клетки), повышение количества CD3+–, CD4+–клеток, Т–киллеров (CD3+CD16+–клетки), синтеза клетками a и g–ИФН, уровня сывороточного IgG, IgA и IgA в слюне. Средний геометрический титр IgG–АТ к бактериальным возбудителям (Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Klebsiella spp., Neisseria spp.), снижается. Титр IgG – AТ к данным возбудителям у ЧБД повышен, что связано с персистенцией инфекции и подтверждается посевами на флору из зева. Снижение титра IgG–АТ может быть связано с уничтожением инфекционных агентов с помощью Т–киллеров и синтеза ИФН. Эффект одного курса препаратов системного действия сохраняется в течение 6 месяцев, а одного курса препаратов топического действия сохраняется в течение 3 месяцев [4,5,6,7]. Обследование ЧБД показало более выраженную персистенцию инфекции в данной группе больных по сравнению с детьми с частотой ОРЗ менее 6 раз в год (табл. 1).
Монокультура выделена у 40% детей, два и более возбудителя – у 46,6% детей, Candida albicans – у 25% детей, сочетанная флора выделена у 25% обследованных детей. С уменьшением частоты ОРЗ уменьшается частота и спектр высеваемых микроорганизмов. Снижение чувствительности возбудителей к различным антибиотикам приводит к персистенции резистентных штаммов у ЧБД (табл. 2).
У 13,3% ЧБД была диагносцирована сопутствующая рецидивирующая герпетическая инфекция (число рецидивов 5–9 раз в году).
У 50% ЧБД были определены антитела к Mycoplasma pneumonia (IgM АТ в титре 1:8–1:32, IgG АТ в титре 1:16–1:64). У 30% детей определены АТ к Chlamydia pneumonia (IgM АТ в титре 1:8–1: 64; IgG АТ в титре 1:16–1:128. У 40–20% детей инфекция подтверждена методом ПЦР–диагностики (Mycoplasma и Chlamydia pneumonia соответственно). У 30% детей инфекция была смешанной. Представленные данные указывают на персистенцию инфекции в носоглотке, при этом подтверждение инфицирования Streptococcus haemoliticus–b, Chlamydia и Mycoplasma pneumonia, является показанием к назначению антибактериальной терапии [8]. Персистенция в первую очередь бактериальной инфекции у ЧБД подтверждает обоснованность назначения бактериальных лизатов.
 По мнению Кубылинской И.А., факторами риска возникновения респираторных инфекций у детей являются возраст (чаще 1–5 лет), время года (чаще зимой), количество детей в организованном коллективе. Бронхо–Ваксом назначали для профилактики инфекций верхних дыхательных путей у детей, посещающих дошкольные и школьные учреждения, детям из групп риска (часто болеющие), детям с иммунодефицитными состояниями. Препарат оказывал профилактическое действие. Повторный курс препарата проводили через 6 месяцев от начала лечения. Эффект Бронхо–Ваксома проявлялся в снижении частоты и длительности инфекций верхних дыхательных путей, в двукратном снижении числа обострений хронических заболеваний ЛОР–органов, уменьшении частоты и тяжести инфекций, потребности в назначении антибиотиков [3].
 При проведении двойного слепого рандомизированного плацебо–контролируемого исследования у 220 детей с повторными респираторными инфекциями назначение Бронхо–Ваксома привело к достоверному снижению частоты инфекций [17].
 Сравнительная оценка клинико–иммунологической эффективности Бронхо–Ваксома была проведена у детей в возрасте 2–7 лет с повторными бронхитами, ринофаринготрахеитами, хроническим аденоидитом в условиях санаторного восстановительного лечения. 19 детей получали санаторное лечение, включавшее диетотерапию, режим, лечебную физкультуру, массаж, поливитамины, санацию носоглотки (фурацилин, календула, эвкалипт, раствор морской соли). 32 ребенка получали Бронхо–Ваксом по стандартной схеме. Через 5 месяцев у детей, получавших Бронхо–Ваксом, в 2 раза снизилось число респираторных инфекций, в 2,4 раза – средняя длительность эпизодов; наиболее значительно снизилась частота повторных бронхитов – в 8 раз [9].
 У взрослых больных с хроническими бронхитами после назначения Бронхо–Ваксома с профилактической целью значительно снижалась частота и тяжесть обострений, потребность в назначении антибиотиков, высеваемость бактериальной флоры из мокроты [11,13].
 У больных с повторными респираторными инфекциями и гипогаммаглобулинемией после лечения Бронхо–Ваксомом отмечено повышение уровня сывороточных IgG, A [15]. У больных с общей вариабельной иммунологической недостаточностью (ОВИН) после приема Бронхо–Ваксома повышался уровень IgA [12]. В настоящее время Бронхо–Ваксом не может быть препаратом выбора при лечении гипогаммаглобулинемии или одной из нозологических форм первичного иммунодефицита – ОВИН, так как при лечении этих заболеваний для повышения уровня иммуноглобулинов чаще используют препараты иммуноглобулинов.
 Необходимо отметить, что назначение одного курса бактериальных лизатов не приводит к полному прекращению эпизодов респираторных инфекций. Профилактический эффект при назначении препаратов вне острого периода можно оценить по частоте эпизодов ОРЗ и динамике иммунологических показателей, в частности, для препаратов системного действия – по динамике показателей системного иммунитета, а для препаратов топического действия – по показателям местного иммунитета [1,4,5,8,6].
Таким образом, применение бактериальных лизатов (Бронхо–Ваксом) сокращает частоту обострений заболеваний бронхо–легочной системы, уменьшает риск быстрого прогрессирования воспалительного процесса в легких, сокращает частоту обострений хронических заболеваний ЛОР–органов (ринита, синусита, ларингита, трахеита), снижает частоту реинфекции ОРВИ. Применение Бронхо–Ваксома снижает потребность в назначении антибиотиков, что позволяет избежать иммуносупрессивного действия антибиотиков, появления устойчивых штаммов и развития других осложнений антибиотикотерапии.

Литература.
1. Богомильский М.Р., Маркова Т.П., Гаращенко Т.И., Чувиров Д.Г. и др. Клинико–иммунологическое обоснование применения топического бактериального иммунокорректора ИРС19 для профилактики заболеваний верхних дыхательных путей у детей. Детский доктор, 2000, № 5, С. 4–7.
2. Караулов А.В., Сокуренко С.И., Бармотин Г.В. Принципы иммунопрофилактики и иммунотерапии рецидивирующих респираторных заболеваний. ММА им. Сеченова, поликлиника МИД РФ. М.,1999.
3. Кубылинская И.А. Фармакотерапия: Применение Бронхо–Ваксома в профилактике и лечении острых и хронических заболеваний ЛОР–органов у детей. Конспект, 2006, № 15 (420).
4. Маркова Т.П., Чувиров Д.Г., Гаращенко Т.И. Механизм действия и эффективность бронхо–мунала в группе длительно и часто болеющих детей. Иммунология, 1999, № 6, С.56–59.
5. Маркова Т.П., Чувиров Д.Г. Применение топических иммуномодуляторов в группе длительно и часто болеющих детей. В кн.: Иммунокоррекция в педиатрии под редакц. М.В.Костинова. М., 2001, С.91–99.
6. Маркова Т.П., Чувиров Д.Г. Бактериальные иммуномодуляторы. РМЖ, 2001, 9 (16–17), С. 703–6.
7. Маркова Т.П., Чувиров Д.Г. Клинико–иммунологическое обоснование применения имудона у длительно и часто болеющих детей. Детский доктор, 2001, № 7, С.2–4.
8. Маркова Т.П., Чувиров Д.Г. Длительно и часто болеющие дети. РМЖ, 2002, т.10, № 3 (147), С. 125–129.
9. Мизерницкий Ю.Л., Мельникова И.М., Марушков В.И. Иммунокоррекция в комплексной терапии респираторных заболеваний. Пульмонология, приложение к Konsilium Medicum, 2005, т. 7, № 16.
10. Овчинников А.Ю., Свистушкин В.М., Никифорова Г.Н. Лечение тонзиллофарингита, как одного из клинических проявлений ОРВИ. Мат–лы IV Всероссийской научно–практической конференции «Надежность и достоверность научной информации в оториноларингологии» (9–10 ноября 2005г., Москва).
11. Li J., Zheng JP., Yuan JP. еt al. Clin.Med.J.Engl., 2004, 21 (14), P. 1053–1068.
12. Litzman J., Lokaj J., Gerylovova A. Allerg. Immunol. (Paris), 1996, 28 (3), P. 81–85.
13. Marialigeti T., Szekely E., Kereky E. Ther. Hung., 1989, 37 (1), P. 28–31.
14. Maul J. Stimulation of immunoprotective mechanisms by OM–85 BV. Respiration, 1994,
№ 61 (Suppl. 1), P.8–15.
15. Quezada A., Maggi L., Perez M., Rodriguez J. J.Investig.Allergol.Clin.Immunol., 1999,
9 (3), P. 178–82.
16. Roth M., Keul R., Papakonstantinou E. et al. Characterization of intracellular signalling transduction and transcription factors involved in Broncho–Vaxom (OM–85 BV) – induced expression of interleukin–6 and interleukin–8 in human pulmonary fibroblasts. Eur.Respir. Rev., 1996, V.6, № 38, P.171–175.
17. Schaad B., Mitterlein R., Goffin H. Chest, 2002, 122, P. 2042–49.
18. Zagar S., Lofler–Badzek D., Cvoriscec BJ. Broncho–Vaxom in children with rhinosinusitis. A double–blind clinical trial. Otorhinolaryngol. Relat. Spec., 1988, v.50, P. 397–404.

.

Внимание! ОРВИ начинаются! » Фармвестник

Пока не началось…

Растительные адаптогены

ЛП и БАД, содержащие комплексы биологических веществ китайского лимонника, женьшеня, элеутерококка, левзеи, эхинацеи пурпурной и т.д., оказывают обще­тонизирующее действие, улучшают способность

организма к адаптации в неблаго­приятных условиях и повышают его устойчивость к инфекционным заболеваниям. При регулярном применении адаптогенов восстанавливается скорость обменных процессов, улучшается эндокринная и вегетативная регуляция, повышается активность специфического и неспецифического иммунитета. Особенно хорошо зарекомендовали себя растительные адаптогены при профилактическом применении у пожилых людей, часто и длительно болеющих детей, ослабленных пациентов (после стрессов, травм, острых заболеваний).

Иммуномодуляторы

Среди иммуномодуляторов принято выделять несколько лекарственных групп: индукторы интерферона и препараты интерферона, интерлейкины, а также стимуляторы иммунитета животного, микробного и синтетического происхождения. Но для посетителей аптеки, которые интересуются средствами для профилактики ОРВИ, главное – это безрецептурный статус препаратов, который позволяет использовать их без назначения врача. Среди разрешенных к самостоятельному использованию иммуномодуляторов можно выделить Кагоцел, меглюмина акридонацетат, тилорон, пидотимод, инозин пранобекс, умифеновир и препараты, содержащие экстракт алоэ, которые разрешены для применения не только у взрослых пациентов, но и у детей.

Конечно, ни один иммуномодулятор не может гарантировать полной защиты от заражения ОРВИ, но даже если избежать инфекции не удастся, протекать она будет легче и с более низким риском осложнений.

Бактериальные лизаты

Препараты на основе бактериальных лизатов (частиц клеток бактерий, не представляющих инфекционной опасности), широко используются для стимуляции как местного иммунитета дыхательных путей, так и общей устойчивости организма к инфекциям. Все препараты бактериальных лизатов содержат несколько штаммов наиболее типичных возбудителей респираторных инфекций. При попадании в организм человека разрушенные бактериальные клетки хотя и не вызывают развитие заболевания, но воспринимаются иммунной системой как угроза. В результате резко повышается образование специфических антител, а также иммуноглобулинов, интерферона, растет активность механизмов неспецифического иммунного ответа. Как правило, препараты бактериальных лизатов рекомендуется использовать у часто и длительно болеющих детей, а также пациентов с хроническими воспалительными заболеваниями.

Солевые растворы

Регулярное промывание и орошение полости носа солевыми растворами (физраствором, морской водой) позволяет значительно

снизить риск заражения ОРВИ даже во время сезонного роста заболеваемости. В основе профилактического действия таких средств лежит несколько механизмов. Во-первых, механическое очищение полости носа от осевших на слизистой оболочке вирусов и бактерий. Во-вторых, увлажнение слизистой оболочки и муколитический эффект, которые способствуют активной работе местного иммунитета. Но для того чтобы применение солевых растворов было эффективным, их следует использовать не реже 3–4 раз в день.

При первых симптомах

Если несмотря на все профилактические меры избежать заражения не удалось, то можно попробовать остановить ОРВИ на самом раннем этапе или хотя бы значительно облегчить ее течение и сократить продолжительность острого течения. Помочь в этом случае могут препараты, обладающие противовирусным действием, а также комбинированные противопростудные средства.

Противовирусные препараты

В рекомендациях ВОЗ для лечения гриппа упоминаются только 2 препарата, оба из группы ингибиторов нейраминидазы – осельтамивир и занамивир. Но при негриппозных ОРВИ, которые в конце лета и начале осени распространены гораздо шире гриппа, эти препараты неэф­фективны. Для лечения ОРВИ в нашей стране используются противовирусные препараты других лекарственных групп: Ингавирин (имидазолилэтанамид пентандиовой кислоты), Циклоферон (меглюмина акридонацетат), Изопринозин и Гроприносин (инозин пранобекс), Арбидол (умифеновир), тилорон (Амиксин, Лавомакс).

Комбинированные симптоматические средства

Одним из самых популярных способов борьбы с симптомами ОРВИ сегодня считаются комбинированные противопростудные препараты – в виде капсул, таблеток или порошков для приготовления горячих напитков.

Как правило, в состав таких средств входит жаропонижающее (парацетамол, иногда ибупрофен), деконгестант (фенилэфрина гидрохлорид, псведоэфедрин), аскорбиновая кислота и антигистаминный компонент (хлорфенамин, фенирамин, лоратадин, прометазин). Некоторые препараты в качестве дополнительных компонентов могут содержать противовирусные или иммуномодулирующие вещества, а также кофеин, глюконат кальция или рутозид.

Благодаря комплексному действию такие ЛП быстро уменьшают тяжесть лихорадки и симптомов интоксикации (мышечную и головную боль, чувство «разбитости», слабости), и больной человек легче переносит острый период ОРВИ. Но провизор обязательно должен напомнить покупателю, приобретающему подобные средства, правила их безопасного применения.

• Не превышать рекомендованные в инструкции частоту приема и дозировку.
• Не совмещать прием комбинированных средств и монопрепаратов, которые дублируют их действие (например, «горячий напиток» и таблетку парацетамола).
• Не использовать подобные средства для лечения детей до 6, а в некоторых случаях до 12 лет.
• Не рекомендуется использовать комбинированные препараты у пациентов с хроническими заболеваниями печени, почек, артериальной гипертензией и глаукомой.

Ангиопротекторы и антиоксиданты

Удачным дополнением к основной терапии ОРВИ могут стать препараты, обладающие антиоксидантным и ангиопротекторным действием. Практически при всех ОРВИ увеличивается проницаемость сосудов, нарушается микроциркуляция и в тканях нарастает содержание свободных радикалов. Это усугубляет токсическое действие вирусной инфекции на организм, создает условия для более тяжелого течения болезни и повышает риск осложнений. Применение антиоксидантов и ангиопротекторов позволяет влиять на патогенетические механизмы ОРВИ и тем самым повышать эффективность лечения. С этой целью могут использоваться как комбинированные, так и монопрепараты, содержащие аскорбиновую и янтарную кислоту, рутозид и глюконат кальция.

И, конечно, каждому покупателю, который интересуется противопростудными препаратами, не лишним будет напомнить о том, что если лечение в домашних условиях не приносит облегчения через 3–5 дней, самым правильным решением будет немедленно обратиться к врачу. Ведь симптомы, напоминающие ОРВИ, могут быть при самых разных заболеваниях!

Противовоспалительные и иммуномодулирующие эффекты бактериального лизата на моделях асептического лимфаденита и пневмококковой пневмонии in vivo | Крышень

1. Блохин Б.М., Стешин В.Ю. Место лизатов бактерий ОМ-85 (Бронхо-Мунал) в профилактике и лечении респираторных заболеваний у детей // Практическая пульмонология, 2016. № 2. С. 29-34. [Blokhin B.M., Steshin V.Yu. Bacterial lysates OM-85 (Broncho-Munal) for prevention and treatment of respiratory infections in children. Prakticheskaya pulmonologiya = Practical Pulmonology, 2016, no. 2, pp. 29-34. (In Russ.)]

2. Директива 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 года по охране животных, используемых в научных целях. [Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes].

3. Калюжин О.В. ОМ-85 в профилактике/лечении респираторных инфекций и обострений хронических заболеваний легких: критерии выбора, механизмы и доказательства // Лечащий врач, 2018. № 3. С. 77-82. [Kalyuzhin O.V. OM-85 in the prevention/treatment of respiratory infections and exacerbations of chronic lung diseases: selection criteria, mechanisms and evidence. Lechashchiy Vrach = Attending Physician, 2018, no. 3, pp. 77-82. (In Russ.)]

4. Калюжин О.В. Топические бактериальные лизаты в профилактике и лечении респираторных инфекций // Практическая медицина, 2016. № 2 (94). С. 69-74. [Kalyuzhin O.V. Topical bacterial lysates in the prevention and treatment of respiratory infections. Prakticheskaya meditsina = Practical Medicine, 2016, no. 2 (94), pp. 69-74. (In Russ.)]

5. Мужикян А.А., Макарова М.Н., Гущин Я.А. Особенности гистологической обработки органов и тканей лабораторных животных // Международный вестник ветеринарии, 2014. № 2. С. 103-108. [Muzhikyan A.A., Makarova M.N., Gushin Ya.A. Features histological processing of organs and tissues of laboratory animals. Mezhdunarodnyy vestnik veterinarii = International Bulletin of Veterinary Medicine, 2014, no. 2, pp. 103-108. (In Russ.)]

6. Мужикян А.А., Ходько С.В., Гущин Я.А., Макарова М.Н., Макаров В.Г. Гистологические изменения в лимфатических узлах крыс при моделировании острого шейного лимфаденита // Международный вестник ветеринарии, 2017. № 1. С. 75-83. [Muzhikyan A.A., Khodko S.V., Gushin Ya.A., Makarova M.N., Makarov V.G. Histological changes in the lymph nodes of rats in modeling acute cervical lymphadenitis .Mezhdunarodnyy vestnik veterinarii = International Bulletin of Veterinary Medicine, 2017, no. 1, pp. 75-83. (In Russ.)]

7. Тесакова С.В., Самусенко И.А., Карачинская И.В., Крышень К.Л., Абрашова Т.В., Макарова М.Н., Макаров В.Г. Экспериментальная модель шейного лимфаденита у крыс для оценки противовоспалительной эффективности препаратов // Профилактическая и клиническая медицина, 2011. № 1 (38). С. 57-62. [Tesakova S.V., Samusenko I.A., Karachinskaya I.V., Kryshen K.L., Abrashova T.V., Makarova M.N., Makarov V.G. Experimental model of cervical lymphadenitis in rats to evaluate the efficacy of anti-inflammatory medicines. Profilakticheskaya i klinicheskaya meditsina = Preventive and Clinical Medicine, 2011, no. 1 (38), pp. 57-62. (In Russ.)]

8. Челябин Э.А., Завьялов А.Е., Куринский В.В., Важжов И.В. Шейный лимфаденит как междисциплинарная проблема // Научный альманах, 2017. № 1-3. С. 256-260. [Cheliabin E.A., Zavyalov A.E., Kurinsky V.V., Vazhzhov I.V. Cervical lymphadenitis as interdisciplinary problem. Nauchnyy almanakh = Scientific Almanac, 2017, no. 1-3, pp. 256-260. (In Russ.)]

9. Bessler W.G., vor dem Esche U., Masihi N. The bacterial extract OM-85 BV protects mice against influenza and Salmonella infection. Int. Immunopharmacol., 2010, Vol. 10, no. 9, pp. 1086-1090.

10. Bodemer C., Guillet G., Cambazard F., Boralevi F., Ballarini S., Milliet C., Bertuccio P., la Vecchia C., Bach J.F., de Prost Y. Adjuvant treatment with the bacterial lysate (OM-85) improves management of atopic dermatitis: A randomized study. PloS ONE, 2017, Vol. 12, no. 3, e0161555. doi: 10.1371/journal.pone.0161555.

11. Cazzola M. A new bacterial lysate protects by reducing infectious exacerbations in moderate to very severe COPD: A double-blind, randomized, placebo-controlled trial. Trends in Medicine, 2006, Vol. 6, no. 3, pp. 191-199.

12. Guidance for Industry. Estimating the maximum safe starting dose in initial clinical trials for therapeutics in adult healthy volunteers: Pharmacology and toxicology. 2005. 30 p.

13. Han L., Zheng C.P., Sun Y.Q., Xu G., Wen W., Fu Q.L. A bacterial extract of OM-85 Broncho-Vaxom prevents allergic rhinitis in mice. Am. J. Rhinol. Allergy, 2014, Vol. 28, no. 2, pp. 110-116.

14. Hvalbye B.K., Aaberge I.S., Løvik M., Haneberg B. Intranasal immunization with heat-inactivated Streptococcus pneumoniae protects mice against systemic pneumococcal infection. Infect. Immun., 1999, Vol. 67, no. 9, pp. 4320-4325.

15. Lewandowski A., Christine M.D., Myers М.J. λ-Carrageenan initiates inflammation via activation of heterodimers TLR2/6 and TLR4/6. J. Immunol., 2018, Vol. 200, Suppl. 1, 42.12.

16. Orcel B., Delclaux B., Baud M., Derenne J.P. Oral immunization with bacterial extracts for protection against acute bronchitis in elderly institutionalized patients with chronic bronchitis. Eur. Respir J., 1994, Vol. 7, pp. 446-452.

17. Roїy A., Chorostowska-Wynimko J. Bacterial immunostimulants-mechanism of action and clinical application in respiratory diseases. Pneumonol. Alergol. Pol., 2008, Vol. 76, no. 5, pp. 353-359.

18. Tao Y., Yuan T., Li X., Yang S., Zhang F., Shi L. Bacterial extract OM-85 BV protects mice against experimental chronic rhinosinusitis. Int. J. Clin. Exp. Pathol., 2015, Vol. 8, no. 6, pp. 6800-6806.

19. Zhong H., Wei J., Yao Y., Fu R., Li H., Fu Q., Wen W. A bacterial extract of OM-85 Broncho-Vaxom suppresses ovalbumin-induced airway inflammation and remodeling in a mouse chronic allergic asthma model. Int. J. Clin. Exp. Pathol., 2017, Vol. 10, no. 2, pp. 1149-1157.

Бактериальные лизаты: что это такое и в чем их польза?

Польза бактерий, или что такое лизаты бактерий и как они действуют

Иммунная система призвана защищать организм от любых чужеродных агентов. Работа иммунной системы реализуется через целый комплекс иммунных реакций. Одними из первых защитных механизмов в ответ на внедрение чужеродных микроорганизмов являются местные иммунные реакции.

Современная медицинская наука имеет в своём арсенале не только эффективные лекарственные средства, позволяющие бороться с теми или иными инфекциями, но и препараты, которые предохраняют организм от развития генерализованного инфекционного процесса. Речь, прежде всего, идет о вакцинах, в ответ на введение которых вырабатываются специфические антитела. Выработка антител в ответ на введение вакцины происходит посредством реализации иммунного ответа. Между тем, на местном уровне происходят похожие процессы.

В настоящее время существуют медикаменты, основным действующим веществом которых являются бактериальные лизаты. Любая бактериальная клетка имеет определенную структуру, заключенную в клеточную оболочку. Химическое или механическое разрушение клеточной оболочки вызывает гибель микроорганизма. Сам процесс разрушения клеточной оболочки называется лизисом. Лизаты – это продукт лизиса бактериальных клеток.

Применение бактериальных лизатов для профилактики острых респираторных заболеваний по механизму действия схоже с действием вакцин. Целью применения лизатов является стимуляция иммунного ответа.

Больше о лизатах бактерий можно узнать из нашего мультика «Лизаты бактерий».

Бактериальный лизат, попадая в организм человека, воспринимается как чужеродный и провоцирует выработку как специфических, так и неспецифических факторов защиты.

Для изготовления бактериальных лизатов используют штаммы патогенных бактерий, которые наиболее часто являются причиной развития острых респираторных инфекций. Это, как правило, не одна, а несколько разновидностей бактерий.

Безусловно, применение любого лекарственного средства должно происходить только по показаниям специалиста и только после предварительной консультации .

Бактериальные лизаты как иммунотерапия респираторных инфекций: методы подготовки

Abstract

Бактериальные лизаты, полученные из микроорганизмов, наиболее часто вызывающих инфекции дыхательных путей (ИРО) человека, присутствуют на рынке в течение нескольких десятилетий, и в настоящее время несколько различных бренды доступны во многих странах мира. Все они утверждали, что обладают местными и системными иммуномодулирующими эффектами, но разные клинические испытания показывают разные результаты.Отсутствие согласованности прогнозируемых терапевтических эффектов подорвало их клиническое использование и затруднило лицензирование в нескольких странах. Одно из объяснений такой непоследовательности результатов состоит в том, что их методы приготовления также очень разные. Здесь мы рассматриваем доступную литературу, описывающую методы приготовления бактериальных лизатов, включая патентные документы. Мы обнаружили среди них большое разнообразие методологий подготовки и отсутствие стандартизированных процедур.Главный вывод нашего исследования заключается в том, что существует очевидная потребность в стандартизированных протоколах производства для получения сопоставимых результатов в клинических испытаниях во всем мире.

Ключевые слова: Инфекции дыхательных путей (ИРО), иммуномодулятор, бактериальные лизаты, механические, щелочные, бактериофаги, вакцина

Введение

Инфекции дыхательных путей (ИРО), такие как острый бронхит, внебольничная пневмония (ВП) и другие являются наиболее распространенными инфекционными заболеваниями людей и вызывают миллионы смертей ежегодно во всем мире (Всемирная организация здравоохранения, 2017).Кроме того, респираторные инфекции являются основным сопутствующим фактором хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ). Хотя за последние пару десятилетий были достигнуты значительные улучшения в лечении и контроле за бременем этих инфекций, все еще отсутствует вакцина против большинства инфекционных агентов, вызывающих ИРО; поэтому необходимо разработать другие профилактические стратегии (Cazzola et al., 2008; Esposito et al., 2018). Одной из стратегий лечения этих инфекций является использование бактериальных лизатов (BL), которые были введены в 1970-х годах в качестве пероральных вакцин для профилактики и лечения ИРО (Cazzola et al., 2012а; Hancock et al., 2012; Эспозито и др., 2018). Эти лизаты представляют собой смеси антигенов, происходящих от инактивированных патогенов, часто участвующих в ИРО.

За последние несколько десятилетий к БЛ вновь обратилось внимание из-за их вклада в сокращение рецидивов ИРО в детстве (Gutiérrez-Tarango and Berber, 2001; Rozy and Chorostowska-Wynimko, 2008; Navarro et al., 2011). Сообщалось также о положительных результатах лечения хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) у взрослых (Cazzola et al., 2012b; Kearney et al., 2015). Исследования показали, что BL являются эффективными иммуностимуляторами, вызывая специфические реакции в локальных областях иммунной системы слизистой оболочки (Braido et al., 2007, 2011; Cazzola et al., 2012b; Kearney et al., 2015).

Несмотря на широкое клиническое использование BL, их влияние на иммунную систему известно лишь частично. Данные большинства исследований показывают, что BL действуют как иммуномодуляторы, способные индуцировать антитела против определенных патогенов, а также иммунорегуляторные реакции в тканях слизистой оболочки (Braido et al., 2011; Cazzola et al., 2012b; Kearney et al., 2015; Эспозито и др., 2018; Triantafillou et al., 2019). В частности, было продемонстрировано, что они могут взаимодействовать с различными клетками через компоненты бактериальной стенки, такие как протеогликаны или липополисахариды, которые взаимодействуют с Toll-подобными рецепторами (TLR) на моноцитах / макрофагах, дендритных или эпителиальных клетках. Эти взаимодействия стимулируют дифференцировку моноцитов в макрофаги и активируют незрелые дендритные клетки, что приводит к выработке выбранных хемокинов и цитокинов.В целом, эти ответы будут вызывать привлечение врожденных эффекторных клеток к участкам слизистой оболочки и индуцировать активацию лимфоцитов, которая может помочь в защите от вторжения патогенов. Некоторые авторы предполагают, что эти реакции действительно создают состояние «предварительной готовности» против инфекции (Kearney et al., 2015).

Отсутствие стандартизованных протоколов может быть препятствием для экспериментальной воспроизводимости иммуностимулирующих эффектов. Разные авторы работали с разными фракциями клеток микроорганизмов в качестве компонентов BL.В частности, различные методы, с помощью которых были приготовлены лизаты, могли способствовать несоответствию между их зарегистрированными биологическими эффектами. Возможно, отсутствие строгости в дизайне эксперимента, недостаточное количество пациентов или другие технические недостатки привели к некоторому уровню недоверия к проведенным клиническим испытаниям (Cazzola et al., 2008). Стандартизированные производственные протоколы были бы полезным шагом на пути к преодолению некоторых текущих трудностей, связанных со сравнением биологических эффектов BL.

Двумя наиболее распространенными методами, используемыми для лизиса бактерий, являются щелочная обработка и механическое разрушение, хотя также использовались тепло или детергенты (Bauer et al., 2008; Braido et al., 2011; Cazzola et al., 2012a). Щелочной лизис может вызывать денатурацию белков бактериальных антигенов, тогда как механическое разрушение предположительно не изменяет антигенные структуры в BL (Kearney et al., 2015; Jurkiewicz and Zielnik-Jurkiewicz, 2018; Triantafillou et al., 2019). Каждый бактериальный штамм выращивают независимо, собирают, инактивируют выбранной процедурой и затем необязательно лиофилизируют.Индивидуальные лизаты смешивают в фиксированных пропорциях, чтобы получить поливалентный BL.

Коммерческие поливалентные бактериальные лизаты доступны в форме пероральных капсул или сублингвальных таблеток (; European Medicines Agency, 2019). Среди наиболее известных — Бронхо-Ваксом® в качестве примера бактериального иммуностимулятора, полученного путем химического лизиса, и Исмиген® или Рибомунил-D 53, состоящий из неизмененных антигенных частиц, полученных путем механического разрушения клеток (Braido et al., 2007; Cazzola et al. ., 2008). Другие коммерчески доступные БЛ используются для лечения других инфекций, таких как инфекции мочевыводящих путей (Huber et al., 2000; Бауэр и др., 2002, 2015; Азиминия и др., 2019; Wawrysiuk et al., 2019) или при рецидиве туберкулеза (Дячик, 2006), также с хорошими результатами.

Таблица 1

Характеристики и клинические результаты коммерческих бактериальных лизатов, используемых для лечения ИРО.

Бактериальный лизат	Бактериальный состав	Метод приготовления	Введение / состав	Клинические результаты
Broncho-Vaxom (Broncho-Vaxom)	С.aureus , S. pneumoniae , S. pyogenes , S. viridans , M. catarrhalis , H. influenzae , K. pneumoniae , K. ozaenae	Щелочной лизис	Капсулы для перорального применения	В педиатрии: Снижение частоты ИРО (Jara-Pérez and Berber, 2000; Gutiérrez-Tarango and Berber, 2001; Schaad, 2010; Esposito et al., 2014) . Сокращение продолжительности ИДТ (Jara-Pérez and Berber, 2000; Gutiérrez-Tarango and Berber, 2001). Снижение потребности в антибиотиках (Jara-Pérez and Berber, 2000; Gutiérrez-Tarango and Berber, 2001; Esposito et al., 2014; Chen et al., 2017). Снижение частоты приступов риносинусита (Chen et al., 2017). У пациентов с ХОБЛ: Снижение частоты обострений (Solèr et al., 2007; Tang et al., 2015). У ВИЧ-положительных пациентов: Снижение частоты ИРО и использования антибиотиков (Capetti et al., 2013).
Liuvac LW50020	S.aureus , S. pneumoniae , S. pyogenes , S. mitis , M. catarrhalis , H. influenzae , K. pneumoniae	Щелочной лизис	Таблетки для приема внутрь	В педиатрии: Снижение частоты и продолжительности ИРО, а также потребности в антибиотиках (Ruah et al., 2001). У взрослых: — Уменьшение количества и продолжительности ИРО и потребности в антибиотиках (Grevers et al., 2000). — Уменьшение количества бактерий у колонизированных пациентов (Zagólski et al., 2015).
Ismigen PBML	S. aureus , S. pneumoniae , S. pyogenes , S. viridans , M. catarrhalis , H. influenzae , K. pneumoniae , K. ozaenae	Механический лизис	Сублингвальные таблетки	В педиатрии: Снижение заболеваемости ИРТ (Rosaschino and Cattaneo, 2004). У пациентов с ХОБЛ: Уменьшение количества дней с повышением температуры тела, госпитализация (Braido et al., 2015), уменьшение количества и интенсивности обострений (Ricci et al., 2014; Braido et al., 2015).
Lantigen B	S. aureus , K. pneumoniae , S. pneumoniae , H. influenzae , M. catarrhalis , S. pyogenes	Щелочной лизис	Капли для перорального применения	Снижение количества острых эпизодов у пациентов с рецидивирующими ИРО (Braido et al., 2014).
Рибомунил D53	K. pneumoniae , S. pneumoniae , S. pyogenes , H. influenzae	Протеогликаны и рибосомы	Пероральные таблетки или гранулы	В педиатрии: Сокращение продолжительности инфекционных эпизодов (Mora et al., 2002; Fiocchi et al., 2012). Снижение заболеваемости ИРО (Mora et al., 2002).

Типы бактериальных лизатов

Щелочные бактериальные лизаты

Щелочной лизис использует ионы гидроксида натрия для разрушения структуры клеточной мембраны за счет изменения pH в пределах 11.5–12,5.

Одним из первых бактериальных лизатов, полученных щелочной экстракцией, был Lantigen B, чьи эффекты in vivo и были впервые описаны в 1970-х годах (Tyrrell et al., 1972) и недавно продемонстрированы Braido et al. (2014). Позже Bauer et al. (1995) запатентовали другой процесс, который включал культивирование Escherichia coli в водной среде с последующей щелочной экстракцией бактериальных белков в присутствии «разбавленного водного источника ионов ОН-». Используемый процесс щелочного лизиса включал концентрирование, ультрафильтрацию, диафильтрацию лизата и лиофилизацию.Авторы далее описали экстракцию липополисахаридов (LPS) с помощью ионообменной хроматографии и характеристику лизата с помощью биохимических анализов аминокислот, рацемизированных во время щелочной экстракции. Кроме того, в патент включены другие процессы лизиса бактерий, вызывающих ИРТ, с изменением концентраций гидроксида натрия (NaOH) (; Bauer et al., 1995).

Таблица 2

Методы приготовления бактериальных лизатов.

Метод лизиса	Бактериальный состав	Лизис (Время ч)	Лизис (Темп)	Используемые биохимические методы анализа лизата	Литература
Щелочной NaOH (конц) 0.01–1%	E. coli	Несколько	30–45 ° C	Ультрафильтрация Диафильтрация	Экстракция LPS (Triton X-114) Ионообменная хроматография Рацемизация аминокислот	Bauer et al., 1995
Щелочной NaOH (конц) 0,1–1,2 N	S. aureus, M . catarrhalis, K . pneumoniae, S . pneumoniae, H . influenzae	от 20 до 40	от 30 до 60 ° C	Центрифугирование Фильтрация Ультрафильтрация	Измерения белков, глутаминовой кислоты и ЛПС	Bauer et al., 2008
Механический Ультразвуковая обработка	S. aureus, M . catarrhalis, K . pneumoniae, S . pneumoniae, H . influenzae	Переменная	от 55 до 65 ° C	Лиофилизация	Определение оптической плотности	Illiarten, 1971
Mecanical Клапан высокого давления	S. aureus, M . catarrhalis, K . pneumoniae, S . pneumoniae, H . influenzae	Не упоминается	Не упоминается	Промывка, фильтрация, центрифугирование, лиофилизация	Метод анализа по Граму Ракетный электрофорез	Мелиоли и Фасани, 2004 г.
Обработка ультразвуком	S. pneumoniae, M. catarrhalis, K . pneumoniae , Micrococcus spp , H.influenzae, Streptococcus spp. (т.е. S. anhemoliticus и S. viridans ).	26	Циклы Нагревание при 70 °, выдержка при 4 ° Дополнительный цикл 70 ° C	Без упоминания Частично частное приготовление	Без упоминания	Coviello et al., 2014
Рибосомные лизаты Гомогенизатор высокого давления	S.pneumoniae, S. pyogenes, K.pneumoniae, H.influenzae, протеогликан K. pneumoniae	—	Низкая температура	Центрифугирование Фильтрация, стерилизация	Не упоминается	Michel et al., 1978
Бактериофаги	S. aureus, K. pneumoniae, P. aeruginosa .	Инкубация 3–48 часов		Фильтрация, лиофилизация	SDS-гель-электрофорез	Pillich and Balcarek, 2011

Бауэр и другие сотрудники запатентовали годы спустя бактериальный экстракт для респираторных инфекций с кратким описанием процесс его приготовления.Это был щелочной лизат, выделенный из штаммов бактерий Staphylococcus aureus, Moraxella catarrhalis, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae и Haemophilus influenzae (Bauer et al., 2008, 2010). Процесс лизирования, описанный в патенте, охватывал ряд разнообразных возможных условий на разных стадиях процесса от ферментации бактерий до полученной модифицированной белковой смеси. По мнению авторов, щелочной лизис каждого штамма или набора штаммов подходит для всех бактерий, вызывающих ИРО.

Среди имеющихся в продаже составов, полученных щелочным лизисом, есть OM-85 BV (Broncho-Vaxom®) и Liuvac (LW-50020). OM-85 BV (Broncho-Vaxom®) представляет собой смесь H. influenzae, S. pneumoniae, K. pneumoniae, Klebsiella ozaenae, S. aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridans и M. catarrhalis . Лювак представляет собой смесь бактериальных лизатов из S. aureus, S. pneumoniae, S. pyogenes, K. pneumoniae, M. catarrhalis и H. influenzae , которая также была оценена для лечения хронического бронхита и ХОБЛ ( Cazzola et al., 2008, 2012b; Эспозито и др., 2018).

Для составов бактериальных лизатов товарных знаков, таких как OM-85 BV (Broncho-vaxom®), нет доступа к подробному протоколу приготовления, в котором указываются, например, концентрации NaOH, температуры или периоды, используемые для процесса лизиса клеток.

Механические бактериальные лизаты

Наиболее широко используемые механические методы лизиса бактериальных клеток — это ультразвуковая обработка и гомогенизация под высоким давлением. Для гомогенизации используются разные давления в зависимости от типа клеток (Goldberg, 2008).

В одном из первых патентов на механическое получение бактериального лизата, обнаруженных в литературе, сообщалось об использовании высушенных и частично лизированных бактериальных антигенов (Illiarten, 1971). Автор описал лизис S. aureus, K. pneumoniae, Haemophilus influenzae, S. pneumoniae и M. catarrhalis путем медленного замораживания с последующим быстрым оттаиванием суспензии клеток в разных диапазонах температур с обработкой ультразвуком в течение разных периодов. времени ().

Melioli и Fasani запатентовали механически лизируемый препарат S.aureus, K. pneumoniae, S. pneumoniae, Haemophilus influenzae и M. catarrhalis , отдельно или в комбинации (Melioli and Fasani, 2004). Бактериальные лизаты в виде частиц получали путем фрагментации бактериальных клеток с использованием клапана высокого давления с последующим отделением неизмененной фракции антигенных частиц от растворимых компонентов центрифугированием, промывкой и фильтрацией ().

Позже Coviello et al. (2014) описали механически полученные лизаты из S.pneumoniae, M.catarrhalis, K. pneumoniae, Micrococcus spp, Haemophilus influenza и Streptoccocus spp. (например, Streptococcus anhemoliticus и S. viridans ) с помощью обработки ультразвуком для разрушения стенок бактериальных клеток. В их конкретном процессе лизиса бактериальный материал подвергался циклам изменений температуры перед тем, как лизат был проанализирован, чтобы подтвердить, что не осталось никаких жизнеспособных организмов (; Coviello et al., 2014).

Самым крупным представителем на рынке препаратов механических лизатов является Ismigen®, который представляет собой поливалентный механический бактериальный лизат (PMBL), состоящий из лизатов из S.aureus, S. pyogenes, S. viridans, K. ozaenae, H. influenzae тип b , M. catarrhalis и S. pneumoniae .

Другой тип механических лизатов — это лизаты, богатые рибосомами. Их получают путем разрушения клеток микростеклянными шариками в гомогенизаторе, методика, впервые описанная в 1965 году (Youmans and Youmans, 1965). Эти авторы показали, что рибосомная фракция, полученная из разрушенных микобактерий, проявляла высокую иммуногенность. С тех пор различные авторы изучали защиту животных с использованием рибосомных фракций бактерий, таких как S.pneumoniae, Salmonella Typhimurium и Neisseria meningitidis (Томпсон и Снайдер, 1971; Веннеман и Берри, 1971; Томас и Вайс, 1972; Свендсен и Джонсон, 1976). Затем Мишель и др. (1978) описали препарат рибосом, экстрагированный из бактериальной биомассы после бактериальной ферментации с последующим механическим разрушением под давлением при низкой температуре, серию центрифугирования для удаления целых клеток и несколько этапов фильтрации и стерилизации для получения бактериального лизата (; Michel et al., 1978). Позже Dussourd d’Hinterland и его коллеги продали интраназальную поливалентную рибосомную вакцину для людей под названием Ribomunyl-D 53, состоящую из рибосомных препаратов из K. pneumoniae, S. pneumoniae, S. pyogenes группы A и Haemophilus influenzae , с мембранный протеогликан некапсулярного штамма K. pneumoniae в качестве адъюванта (Dussourd d’Hinterland et al., 1980). Было проведено несколько исследований, показывающих его эффективность в качестве иммуностимуляторов (Lauener, 1994; Clot, 1997; Caliot et al., 2000; Bellanti et al., 2003; Буске и Фиокки, 2006). По сравнению со щелочными бактериальными экстрактами, такими как OM85 BV, было показано, что D53 индуцирует больше клеток, продуцирующих антитела, в миндалинах леченных детей, и авторы предположили, что частично транскрибируемые белки, присутствующие в обогащенном рибосомами препарате, могут содержать мощные эпитопы, которые будут взаимодействовать с иммунокомпетентными клетками. более эффективно, чем крупные белки, присутствующие в бактериальном экстракте (Béné et al., 1993).

В целом, механическое разрушение клеток оказалось эффективным методом, обеспечивающим лизис 80–100% бактерий (Cazzola et al., 2012а). Как ранее предлагали другие авторы, механические лизаты содержат частицы, которые сохраняют некоторые свойства интактных антигенных молекул, тем самым обеспечивая лучшее взаимодействие с Toll-подобными рецепторами, что является одной из первоначальных целей этих препаратов (Villa et al., 2010; Cazzola et al. ., 2012a, b; Esposito et al., 2018; Triantafillou et al., 2019). Однако этот способ имеет ограничение тепловыделения, которое необходимо минимизировать, чтобы избежать денатурализации белка в процессе, и он более дорог, чем щелочной лизис.

Препараты бактериальных лизатов с помощью бактериофагов

Бактериальные лизаты, полученные путем заражения бактерий выбранными бактериофагами, были запатентованы в 2011 году Пиллихом и Балкареком, которые работали с бактериальными лизатами с 2003 года (Pillich and Balcarek, 2011). Первоначальная идея восходит к 1917 году, когда использование бактериофагов для лечения бактериальных заболеваний было предложено D ‘Herelle (Fruciano and Bourne, 2007).

Авторы приготовили лизаты бактерий из штаммов S.aureus, K. pneumoniae и Pseudomonas aeruginosa . Они инкубировали бактериофаги с бактериальной культурой в течение определенного периода. Полученные лизаты, содержащие клеточные материалы, такие как компоненты клеточной стенки, клеточные мембраны, белки, рибосомные фракции, гликопротеины, ДНК и РНК, затем фильтровали и стерилизовали. Авторы предположили, что использование бактериофагов эффективно против всех видов бактерий.

Поскольку протокол запатентован, авторы не предоставили конкретных подробностей о времени инкубации или дозах бактериофагов.Тем не менее, приводится приблизительная концентрация культуры бактериофагов, а также приблизительное время инкубации (от 3 до 48 часов). Методы, используемые для определения антигенного паттерна, приведены в (Rothbard et al., 2014).

Клинические эффекты

Было проведено множество клинических исследований для оценки иммуностимулирующего эффекта бактериальных лизатов, оцениваемого как положительное воздействие на пациентов, восприимчивых к инфекциям дыхательных путей (ИРО) в детском, пожилом возрасте или пациентов с ХОБЛ.Среди всех бактериальных лизатов, описанных в литературе, наибольшее количество клинических испытаний было выполнено на OM-85 BV (Broncho-vaxom®) и Ismigen® (PMBL) в качестве примеров химического или механического лизиса соответственно (Bessler et al., 2010; Navarro et al., 2011; Lanzilli et al., 2013; Tang et al., 2015).

OM-85 показал хорошую безопасность и переносимость во многих исследованиях с уменьшением рецидивов респираторных инфекций у детей и взрослых (Jara-Pérez and Berber, 2000; Gutiérrez-Tarango and Berber, 2001; Solèr et al., 2007; Шаад, 2010). Метаанализ восьми рандомизированных контролируемых исследований, проведенных Schaad et al., Показал снижение случаев рецидивов ИРО среди детей, получавших OM-85 (Schaad, 2010). Затем другой метаанализ также подтвердил эти данные и показал защитный эффект ОМ-85 при рецидивирующих ИРО у детей (Yin et al., 2018; Esposito et al., 2019). Что касается пациентов с ХОБЛ, метаанализ, опубликованный Pan et al., Пришел к выводу, что имеющихся данных недостаточно для подтверждения положительного эффекта OM-85BV у пациентов с ХОБЛ с точки зрения продолжительности госпитализации, тяжести обострения и общего количества побочных эффектов. (Пан и др., 2015).

В целом авторы согласны с тем, что среди уже проведенных испытаний есть некоторые ограничения, поэтому существует необходимость в высококачественных, больших, многоцентровых, двойных слепых, плацебо-контролируемых рандомизированных клинических испытаниях, чтобы подтвердить роль иммуностимуляторов. в профилактике ИРО у детей (Del-Rio-Navarro et al., 2012), а также взрослых или пациентов с ХОБЛ (Pan et al., 2015).

С другой стороны, существует также много клинических исследований с использованием BL, полученных механическим разрушением, показывающих многообещающие результаты.Rosaschino и Cattaneo (2004) оценили эффективность и переносимость у педиатрических пациентов, получавших PMBL, и продемонстрировали, что лечение было эффективным при отличной переносимости BL (Rosaschino and Cattaneo, 2004). Брейдо и Мелиоли изучали другой препарат лизата, названный Лантиген В, у пациентов с рецидивирующими ИРО и продемонстрировали значительное снижение количества острых эпизодов у этих пациентов (Braido et al., 2014).

Результаты активности BL в качестве вакцины были описаны как частично зависящие от используемого патогенного штамма, частично (в случае рибосомных BL) от степени чистоты субклеточной фракции и частично от присутствия или отсутствия других клеток. составляющие, такие как полисахариды (Michel et al., 1978). Различные типы иммунных ответов (клеточно-опосредованные или гуморальные) были вызваны в разных исследованиях. Пути введения включают назальный, сублингвальный, а также оральный (Schaad, 2010; Cazzola et al., 2012a; Rial et al., 2016).

Таким образом, несколько исследований показали положительный эффект лечения бактериальными экстрактами, полученными с помощью механических или химических процедур. Как уже упоминалось, некоторые авторы заявили, что механическое разрушение может быть лучшей альтернативой химическому лизису из-за сохранения антигенов.Однако не проводилось исследований, сравнивающих биологические эффекты поливалентных бактериальных лизатов, приготовленных из тех же бактериальных культур, но с использованием механических или химических процедур лизата (механических или химических). Эти сравнительные исследования могут пролить свет на выбор лучшего метода приготовления лизатов иммуностимуляторов.

Перспективы на будущее

В течение многих лет использовалось несколько методов для приготовления клеточных лизатов (например, щелочная обработка или механическое разрушение).Поскольку механическое разрушение считается наиболее перспективным способом лизиса клеток, некоторые компании достигли значительного технологического прогресса в этой области (Cazzola et al., 2012a; Jurkiewicz and Zielnik-Jurkiewicz, 2018; Esposito et al., 2019 ). Они разработали сфокусированную ультразвуковую обработку, передовую технологию с компьютерным управлением, которая может контролировать дозировку энергии, доставляемой для мягкого разрушения клеточных мембран клеток млекопитающих или внезапного разрушения клеточных стенок бактерий. Эта технология может решить проблемы стандартизации процедур получения механических бактериальных лизатов (Wenger et al., 2008; Bláha et al., 2017).

Бактериальные лизаты как иммунотерапия респираторных инфекций: методы приготовления

Резюме

Бактериальные лизаты, приготовленные из микроорганизмов, наиболее часто вызывающих инфекции дыхательных путей (ИРО), присутствуют на рынке уже несколько десятилетий, а в настоящее время уже несколько различные бренды доступны во многих странах мира. Все они утверждали, что обладают местными и системными иммуномодулирующими эффектами, но разные клинические испытания показывают разные результаты.Отсутствие согласованности прогнозируемых терапевтических эффектов подорвало их клиническое использование и затруднило лицензирование в нескольких странах. Одно из объяснений такой непоследовательности результатов состоит в том, что их методы приготовления также очень разные. Здесь мы рассматриваем доступную литературу, описывающую методы приготовления бактериальных лизатов, включая патентные документы. Мы обнаружили среди них большое разнообразие методологий подготовки и отсутствие стандартизированных процедур.Главный вывод нашего исследования заключается в том, что существует очевидная потребность в стандартизированных протоколах производства для получения сопоставимых результатов в клинических испытаниях во всем мире.

Ключевые слова: Инфекции дыхательных путей (ИРО), иммуномодулятор, бактериальные лизаты, механические, щелочные, бактериофаги, вакцина

Введение

Инфекции дыхательных путей (ИРО), такие как острый бронхит, внебольничная пневмония (ВП) и другие являются наиболее распространенными инфекционными заболеваниями людей и вызывают миллионы смертей ежегодно во всем мире (Всемирная организация здравоохранения, 2017).Кроме того, респираторные инфекции являются основным сопутствующим фактором хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ). Хотя за последние пару десятилетий были достигнуты значительные улучшения в лечении и контроле за бременем этих инфекций, все еще отсутствует вакцина против большинства инфекционных агентов, вызывающих ИРО; поэтому необходимо разработать другие профилактические стратегии (Cazzola et al., 2008; Esposito et al., 2018). Одной из стратегий лечения этих инфекций является использование бактериальных лизатов (BL), которые были введены в 1970-х годах в качестве пероральных вакцин для профилактики и лечения ИРО (Cazzola et al., 2012а; Hancock et al., 2012; Эспозито и др., 2018). Эти лизаты представляют собой смеси антигенов, происходящих от инактивированных патогенов, часто участвующих в ИРО.

За последние несколько десятилетий к БЛ вновь обратилось внимание из-за их вклада в сокращение рецидивов ИРО в детстве (Gutiérrez-Tarango and Berber, 2001; Rozy and Chorostowska-Wynimko, 2008; Navarro et al., 2011). Сообщалось также о положительных результатах лечения хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) у взрослых (Cazzola et al., 2012b; Kearney et al., 2015). Исследования показали, что BL являются эффективными иммуностимуляторами, вызывая специфические реакции в локальных областях иммунной системы слизистой оболочки (Braido et al., 2007, 2011; Cazzola et al., 2012b; Kearney et al., 2015).

Несмотря на широкое клиническое использование BL, их влияние на иммунную систему известно лишь частично. Данные большинства исследований показывают, что BL действуют как иммуномодуляторы, способные индуцировать антитела против определенных патогенов, а также иммунорегуляторные реакции в тканях слизистой оболочки (Braido et al., 2011; Cazzola et al., 2012b; Kearney et al., 2015; Эспозито и др., 2018; Triantafillou et al., 2019). В частности, было продемонстрировано, что они могут взаимодействовать с различными клетками через компоненты бактериальной стенки, такие как протеогликаны или липополисахариды, которые взаимодействуют с Toll-подобными рецепторами (TLR) на моноцитах / макрофагах, дендритных или эпителиальных клетках. Эти взаимодействия стимулируют дифференцировку моноцитов в макрофаги и активируют незрелые дендритные клетки, что приводит к выработке выбранных хемокинов и цитокинов.В целом, эти ответы будут вызывать привлечение врожденных эффекторных клеток к участкам слизистой оболочки и индуцировать активацию лимфоцитов, которая может помочь в защите от вторжения патогенов. Некоторые авторы предполагают, что эти реакции действительно создают состояние «предварительной готовности» против инфекции (Kearney et al., 2015).

Отсутствие стандартизованных протоколов может быть препятствием для экспериментальной воспроизводимости иммуностимулирующих эффектов. Разные авторы работали с разными фракциями клеток микроорганизмов в качестве компонентов BL.В частности, различные методы, с помощью которых были приготовлены лизаты, могли способствовать несоответствию между их зарегистрированными биологическими эффектами. Возможно, отсутствие строгости в дизайне эксперимента, недостаточное количество пациентов или другие технические недостатки привели к некоторому уровню недоверия к проведенным клиническим испытаниям (Cazzola et al., 2008). Стандартизированные производственные протоколы были бы полезным шагом на пути к преодолению некоторых текущих трудностей, связанных со сравнением биологических эффектов BL.

Двумя наиболее распространенными методами, используемыми для лизиса бактерий, являются щелочная обработка и механическое разрушение, хотя также использовались тепло или детергенты (Bauer et al., 2008; Braido et al., 2011; Cazzola et al., 2012a). Щелочной лизис может вызывать денатурацию белков бактериальных антигенов, тогда как механическое разрушение предположительно не изменяет антигенные структуры в BL (Kearney et al., 2015; Jurkiewicz and Zielnik-Jurkiewicz, 2018; Triantafillou et al., 2019). Каждый бактериальный штамм выращивают независимо, собирают, инактивируют выбранной процедурой и затем необязательно лиофилизируют.Индивидуальные лизаты смешивают в фиксированных пропорциях, чтобы получить поливалентный BL.

Коммерческие поливалентные бактериальные лизаты доступны в форме пероральных капсул или сублингвальных таблеток (; European Medicines Agency, 2019). Среди наиболее известных — Бронхо-Ваксом® в качестве примера бактериального иммуностимулятора, полученного путем химического лизиса, и Исмиген® или Рибомунил-D 53, состоящий из неизмененных антигенных частиц, полученных путем механического разрушения клеток (Braido et al., 2007; Cazzola et al. ., 2008). Другие коммерчески доступные БЛ используются для лечения других инфекций, таких как инфекции мочевыводящих путей (Huber et al., 2000; Бауэр и др., 2002, 2015; Азиминия и др., 2019; Wawrysiuk et al., 2019) или при рецидиве туберкулеза (Дячик, 2006), также с хорошими результатами.

Таблица 1

Характеристики и клинические результаты коммерческих бактериальных лизатов, используемых для лечения ИРО.

Бактериальный лизат	Бактериальный состав	Метод приготовления	Введение / состав	Клинические результаты
Broncho-Vaxom (Broncho-Vaxom)	С.aureus , S. pneumoniae , S. pyogenes , S. viridans , M. catarrhalis , H. influenzae , K. pneumoniae , K. ozaenae	Щелочной лизис	Капсулы для перорального применения	В педиатрии: Снижение частоты ИРО (Jara-Pérez and Berber, 2000; Gutiérrez-Tarango and Berber, 2001; Schaad, 2010; Esposito et al., 2014) . Сокращение продолжительности ИДТ (Jara-Pérez and Berber, 2000; Gutiérrez-Tarango and Berber, 2001). Снижение потребности в антибиотиках (Jara-Pérez and Berber, 2000; Gutiérrez-Tarango and Berber, 2001; Esposito et al., 2014; Chen et al., 2017). Снижение частоты приступов риносинусита (Chen et al., 2017). У пациентов с ХОБЛ: Снижение частоты обострений (Solèr et al., 2007; Tang et al., 2015). У ВИЧ-положительных пациентов: Снижение частоты ИРО и использования антибиотиков (Capetti et al., 2013).
Liuvac LW50020	S.aureus , S. pneumoniae , S. pyogenes , S. mitis , M. catarrhalis , H. influenzae , K. pneumoniae	Щелочной лизис	Таблетки для приема внутрь	В педиатрии: Снижение частоты и продолжительности ИРО, а также потребности в антибиотиках (Ruah et al., 2001). У взрослых: — Уменьшение количества и продолжительности ИРО и потребности в антибиотиках (Grevers et al., 2000). — Уменьшение количества бактерий у колонизированных пациентов (Zagólski et al., 2015).
Ismigen PBML	S. aureus , S. pneumoniae , S. pyogenes , S. viridans , M. catarrhalis , H. influenzae , K. pneumoniae , K. ozaenae	Механический лизис	Сублингвальные таблетки	В педиатрии: Снижение заболеваемости ИРТ (Rosaschino and Cattaneo, 2004). У пациентов с ХОБЛ: Уменьшение количества дней с повышением температуры тела, госпитализация (Braido et al., 2015), уменьшение количества и интенсивности обострений (Ricci et al., 2014; Braido et al., 2015).
Lantigen B	S. aureus , K. pneumoniae , S. pneumoniae , H. influenzae , M. catarrhalis , S. pyogenes	Щелочной лизис	Капли для перорального применения	Снижение количества острых эпизодов у пациентов с рецидивирующими ИРО (Braido et al., 2014).
Рибомунил D53	K. pneumoniae , S. pneumoniae , S. pyogenes , H. influenzae	Протеогликаны и рибосомы	Пероральные таблетки или гранулы	В педиатрии: Сокращение продолжительности инфекционных эпизодов (Mora et al., 2002; Fiocchi et al., 2012). Снижение заболеваемости ИРО (Mora et al., 2002).

Типы бактериальных лизатов

Щелочные бактериальные лизаты

Щелочной лизис использует ионы гидроксида натрия для разрушения структуры клеточной мембраны за счет изменения pH в пределах 11.5–12,5.

Одним из первых бактериальных лизатов, полученных щелочной экстракцией, был Lantigen B, чьи эффекты in vivo и были впервые описаны в 1970-х годах (Tyrrell et al., 1972) и недавно продемонстрированы Braido et al. (2014). Позже Bauer et al. (1995) запатентовали другой процесс, который включал культивирование Escherichia coli в водной среде с последующей щелочной экстракцией бактериальных белков в присутствии «разбавленного водного источника ионов ОН-». Используемый процесс щелочного лизиса включал концентрирование, ультрафильтрацию, диафильтрацию лизата и лиофилизацию.Авторы далее описали экстракцию липополисахаридов (LPS) с помощью ионообменной хроматографии и характеристику лизата с помощью биохимических анализов аминокислот, рацемизированных во время щелочной экстракции. Кроме того, в патент включены другие процессы лизиса бактерий, вызывающих ИРТ, с изменением концентраций гидроксида натрия (NaOH) (; Bauer et al., 1995).

Таблица 2

Методы приготовления бактериальных лизатов.

Метод лизиса	Бактериальный состав	Лизис (Время ч)	Лизис (Темп)	Используемые биохимические методы анализа лизата	Литература
Щелочной NaOH (конц) 0.01–1%	E. coli	Несколько	30–45 ° C	Ультрафильтрация Диафильтрация	Экстракция LPS (Triton X-114) Ионообменная хроматография Рацемизация аминокислот	Bauer et al., 1995
Щелочной NaOH (конц) 0,1–1,2 N	S. aureus, M . catarrhalis, K . pneumoniae, S . pneumoniae, H . influenzae	от 20 до 40	от 30 до 60 ° C	Центрифугирование Фильтрация Ультрафильтрация	Измерения белков, глутаминовой кислоты и ЛПС	Bauer et al., 2008
Механический Ультразвуковая обработка	S. aureus, M . catarrhalis, K . pneumoniae, S . pneumoniae, H . influenzae	Переменная	от 55 до 65 ° C	Лиофилизация	Определение оптической плотности	Illiarten, 1971
Mecanical Клапан высокого давления	S. aureus, M . catarrhalis, K . pneumoniae, S . pneumoniae, H . influenzae	Не упоминается	Не упоминается	Промывка, фильтрация, центрифугирование, лиофилизация	Метод анализа по Граму Ракетный электрофорез	Мелиоли и Фасани, 2004 г.
Обработка ультразвуком	S. pneumoniae, M. catarrhalis, K . pneumoniae , Micrococcus spp , H.influenzae, Streptococcus spp. (т.е. S. anhemoliticus и S. viridans ).	26	Циклы Нагревание при 70 °, выдержка при 4 ° Дополнительный цикл 70 ° C	Без упоминания Частично частное приготовление	Без упоминания	Coviello et al., 2014
Рибосомные лизаты Гомогенизатор высокого давления	S.pneumoniae, S. pyogenes, K.pneumoniae, H.influenzae, протеогликан K. pneumoniae	—	Низкая температура	Центрифугирование Фильтрация, стерилизация	Не упоминается	Michel et al., 1978
Бактериофаги	S. aureus, K. pneumoniae, P. aeruginosa .	Инкубация 3–48 часов		Фильтрация, лиофилизация	SDS-гель-электрофорез	Pillich and Balcarek, 2011

Бауэр и другие сотрудники запатентовали годы спустя бактериальный экстракт для респираторных инфекций с кратким описанием процесс его приготовления.Это был щелочной лизат, выделенный из штаммов бактерий Staphylococcus aureus, Moraxella catarrhalis, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae и Haemophilus influenzae (Bauer et al., 2008, 2010). Процесс лизирования, описанный в патенте, охватывал ряд разнообразных возможных условий на разных стадиях процесса от ферментации бактерий до полученной модифицированной белковой смеси. По мнению авторов, щелочной лизис каждого штамма или набора штаммов подходит для всех бактерий, вызывающих ИРО.

Среди имеющихся в продаже составов, полученных щелочным лизисом, есть OM-85 BV (Broncho-Vaxom®) и Liuvac (LW-50020). OM-85 BV (Broncho-Vaxom®) представляет собой смесь H. influenzae, S. pneumoniae, K. pneumoniae, Klebsiella ozaenae, S. aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridans и M. catarrhalis . Лювак представляет собой смесь бактериальных лизатов из S. aureus, S. pneumoniae, S. pyogenes, K. pneumoniae, M. catarrhalis и H. influenzae , которая также была оценена для лечения хронического бронхита и ХОБЛ ( Cazzola et al., 2008, 2012b; Эспозито и др., 2018).

Для составов бактериальных лизатов товарных знаков, таких как OM-85 BV (Broncho-vaxom®), нет доступа к подробному протоколу приготовления, в котором указываются, например, концентрации NaOH, температуры или периоды, используемые для процесса лизиса клеток.

Механические бактериальные лизаты

Наиболее широко используемые механические методы лизиса бактериальных клеток — это ультразвуковая обработка и гомогенизация под высоким давлением. Для гомогенизации используются разные давления в зависимости от типа клеток (Goldberg, 2008).

В одном из первых патентов на механическое получение бактериального лизата, обнаруженных в литературе, сообщалось об использовании высушенных и частично лизированных бактериальных антигенов (Illiarten, 1971). Автор описал лизис S. aureus, K. pneumoniae, Haemophilus influenzae, S. pneumoniae и M. catarrhalis путем медленного замораживания с последующим быстрым оттаиванием суспензии клеток в разных диапазонах температур с обработкой ультразвуком в течение разных периодов. времени ().

Melioli и Fasani запатентовали механически лизируемый препарат S.aureus, K. pneumoniae, S. pneumoniae, Haemophilus influenzae и M. catarrhalis , отдельно или в комбинации (Melioli and Fasani, 2004). Бактериальные лизаты в виде частиц получали путем фрагментации бактериальных клеток с использованием клапана высокого давления с последующим отделением неизмененной фракции антигенных частиц от растворимых компонентов центрифугированием, промывкой и фильтрацией ().

Позже Coviello et al. (2014) описали механически полученные лизаты из S.pneumoniae, M.catarrhalis, K. pneumoniae, Micrococcus spp, Haemophilus influenza и Streptoccocus spp. (например, Streptococcus anhemoliticus и S. viridans ) с помощью обработки ультразвуком для разрушения стенок бактериальных клеток. В их конкретном процессе лизиса бактериальный материал подвергался циклам изменений температуры перед тем, как лизат был проанализирован, чтобы подтвердить, что не осталось никаких жизнеспособных организмов (; Coviello et al., 2014).

Самым крупным представителем на рынке препаратов механических лизатов является Ismigen®, который представляет собой поливалентный механический бактериальный лизат (PMBL), состоящий из лизатов из S.aureus, S. pyogenes, S. viridans, K. ozaenae, H. influenzae тип b , M. catarrhalis и S. pneumoniae .

Другой тип механических лизатов — это лизаты, богатые рибосомами. Их получают путем разрушения клеток микростеклянными шариками в гомогенизаторе, методика, впервые описанная в 1965 году (Youmans and Youmans, 1965). Эти авторы показали, что рибосомная фракция, полученная из разрушенных микобактерий, проявляла высокую иммуногенность. С тех пор различные авторы изучали защиту животных с использованием рибосомных фракций бактерий, таких как S.pneumoniae, Salmonella Typhimurium и Neisseria meningitidis (Томпсон и Снайдер, 1971; Веннеман и Берри, 1971; Томас и Вайс, 1972; Свендсен и Джонсон, 1976). Затем Мишель и др. (1978) описали препарат рибосом, экстрагированный из бактериальной биомассы после бактериальной ферментации с последующим механическим разрушением под давлением при низкой температуре, серию центрифугирования для удаления целых клеток и несколько этапов фильтрации и стерилизации для получения бактериального лизата (; Michel et al., 1978). Позже Dussourd d’Hinterland и его коллеги продали интраназальную поливалентную рибосомную вакцину для людей под названием Ribomunyl-D 53, состоящую из рибосомных препаратов из K. pneumoniae, S. pneumoniae, S. pyogenes группы A и Haemophilus influenzae , с мембранный протеогликан некапсулярного штамма K. pneumoniae в качестве адъюванта (Dussourd d’Hinterland et al., 1980). Было проведено несколько исследований, показывающих его эффективность в качестве иммуностимуляторов (Lauener, 1994; Clot, 1997; Caliot et al., 2000; Bellanti et al., 2003; Буске и Фиокки, 2006). По сравнению со щелочными бактериальными экстрактами, такими как OM85 BV, было показано, что D53 индуцирует больше клеток, продуцирующих антитела, в миндалинах леченных детей, и авторы предположили, что частично транскрибируемые белки, присутствующие в обогащенном рибосомами препарате, могут содержать мощные эпитопы, которые будут взаимодействовать с иммунокомпетентными клетками. более эффективно, чем крупные белки, присутствующие в бактериальном экстракте (Béné et al., 1993).

В целом, механическое разрушение клеток оказалось эффективным методом, обеспечивающим лизис 80–100% бактерий (Cazzola et al., 2012а). Как ранее предлагали другие авторы, механические лизаты содержат частицы, которые сохраняют некоторые свойства интактных антигенных молекул, тем самым обеспечивая лучшее взаимодействие с Toll-подобными рецепторами, что является одной из первоначальных целей этих препаратов (Villa et al., 2010; Cazzola et al. ., 2012a, b; Esposito et al., 2018; Triantafillou et al., 2019). Однако этот способ имеет ограничение тепловыделения, которое необходимо минимизировать, чтобы избежать денатурализации белка в процессе, и он более дорог, чем щелочной лизис.

Препараты бактериальных лизатов с помощью бактериофагов

Бактериальные лизаты, полученные путем заражения бактерий выбранными бактериофагами, были запатентованы в 2011 году Пиллихом и Балкареком, которые работали с бактериальными лизатами с 2003 года (Pillich and Balcarek, 2011). Первоначальная идея восходит к 1917 году, когда использование бактериофагов для лечения бактериальных заболеваний было предложено D ‘Herelle (Fruciano and Bourne, 2007).

Авторы приготовили лизаты бактерий из штаммов S.aureus, K. pneumoniae и Pseudomonas aeruginosa . Они инкубировали бактериофаги с бактериальной культурой в течение определенного периода. Полученные лизаты, содержащие клеточные материалы, такие как компоненты клеточной стенки, клеточные мембраны, белки, рибосомные фракции, гликопротеины, ДНК и РНК, затем фильтровали и стерилизовали. Авторы предположили, что использование бактериофагов эффективно против всех видов бактерий.

Поскольку протокол запатентован, авторы не предоставили конкретных подробностей о времени инкубации или дозах бактериофагов.Тем не менее, приводится приблизительная концентрация культуры бактериофагов, а также приблизительное время инкубации (от 3 до 48 часов). Методы, используемые для определения антигенного паттерна, приведены в (Rothbard et al., 2014).

Клинические эффекты

Было проведено множество клинических исследований для оценки иммуностимулирующего эффекта бактериальных лизатов, оцениваемого как положительное воздействие на пациентов, восприимчивых к инфекциям дыхательных путей (ИРО) в детском, пожилом возрасте или пациентов с ХОБЛ.Среди всех бактериальных лизатов, описанных в литературе, наибольшее количество клинических испытаний было выполнено на OM-85 BV (Broncho-vaxom®) и Ismigen® (PMBL) в качестве примеров химического или механического лизиса соответственно (Bessler et al., 2010; Navarro et al., 2011; Lanzilli et al., 2013; Tang et al., 2015).

OM-85 показал хорошую безопасность и переносимость во многих исследованиях с уменьшением рецидивов респираторных инфекций у детей и взрослых (Jara-Pérez and Berber, 2000; Gutiérrez-Tarango and Berber, 2001; Solèr et al., 2007; Шаад, 2010). Метаанализ восьми рандомизированных контролируемых исследований, проведенных Schaad et al., Показал снижение случаев рецидивов ИРО среди детей, получавших OM-85 (Schaad, 2010). Затем другой метаанализ также подтвердил эти данные и показал защитный эффект ОМ-85 при рецидивирующих ИРО у детей (Yin et al., 2018; Esposito et al., 2019). Что касается пациентов с ХОБЛ, метаанализ, опубликованный Pan et al., Пришел к выводу, что имеющихся данных недостаточно для подтверждения положительного эффекта OM-85BV у пациентов с ХОБЛ с точки зрения продолжительности госпитализации, тяжести обострения и общего количества побочных эффектов. (Пан и др., 2015).

В целом авторы согласны с тем, что среди уже проведенных испытаний есть некоторые ограничения, поэтому существует необходимость в высококачественных, больших, многоцентровых, двойных слепых, плацебо-контролируемых рандомизированных клинических испытаниях, чтобы подтвердить роль иммуностимуляторов. в профилактике ИРО у детей (Del-Rio-Navarro et al., 2012), а также взрослых или пациентов с ХОБЛ (Pan et al., 2015).

С другой стороны, существует также много клинических исследований с использованием BL, полученных механическим разрушением, показывающих многообещающие результаты.Rosaschino и Cattaneo (2004) оценили эффективность и переносимость у педиатрических пациентов, получавших PMBL, и продемонстрировали, что лечение было эффективным при отличной переносимости BL (Rosaschino and Cattaneo, 2004). Брейдо и Мелиоли изучали другой препарат лизата, названный Лантиген В, у пациентов с рецидивирующими ИРО и продемонстрировали значительное снижение количества острых эпизодов у этих пациентов (Braido et al., 2014).

Результаты активности BL в качестве вакцины были описаны как частично зависящие от используемого патогенного штамма, частично (в случае рибосомных BL) от степени чистоты субклеточной фракции и частично от присутствия или отсутствия других клеток. составляющие, такие как полисахариды (Michel et al., 1978). Различные типы иммунных ответов (клеточно-опосредованные или гуморальные) были вызваны в разных исследованиях. Пути введения включают назальный, сублингвальный, а также оральный (Schaad, 2010; Cazzola et al., 2012a; Rial et al., 2016).

Таким образом, несколько исследований показали положительный эффект лечения бактериальными экстрактами, полученными с помощью механических или химических процедур. Как уже упоминалось, некоторые авторы заявили, что механическое разрушение может быть лучшей альтернативой химическому лизису из-за сохранения антигенов.Однако не проводилось исследований, сравнивающих биологические эффекты поливалентных бактериальных лизатов, приготовленных из тех же бактериальных культур, но с использованием механических или химических процедур лизата (механических или химических). Эти сравнительные исследования могут пролить свет на выбор лучшего метода приготовления лизатов иммуностимуляторов.

Перспективы на будущее

В течение многих лет использовалось несколько методов для приготовления клеточных лизатов (например, щелочная обработка или механическое разрушение).Поскольку механическое разрушение считается наиболее перспективным способом лизиса клеток, некоторые компании достигли значительного технологического прогресса в этой области (Cazzola et al., 2012a; Jurkiewicz and Zielnik-Jurkiewicz, 2018; Esposito et al., 2019 ). Они разработали сфокусированную ультразвуковую обработку, передовую технологию с компьютерным управлением, которая может контролировать дозировку энергии, доставляемой для мягкого разрушения клеточных мембран клеток млекопитающих или внезапного разрушения клеточных стенок бактерий. Эта технология может решить проблемы стандартизации процедур получения механических бактериальных лизатов (Wenger et al., 2008; Bláha et al., 2017).

Бактериальные лизаты как иммунотерапия респираторных инфекций: методы приготовления

Резюме

Бактериальные лизаты, приготовленные из микроорганизмов, наиболее часто вызывающих инфекции дыхательных путей (ИРО), присутствуют на рынке уже несколько десятилетий, а в настоящее время уже несколько различные бренды доступны во многих странах мира. Все они утверждали, что обладают местными и системными иммуномодулирующими эффектами, но разные клинические испытания показывают разные результаты.Отсутствие согласованности прогнозируемых терапевтических эффектов подорвало их клиническое использование и затруднило лицензирование в нескольких странах. Одно из объяснений такой непоследовательности результатов состоит в том, что их методы приготовления также очень разные. Здесь мы рассматриваем доступную литературу, описывающую методы приготовления бактериальных лизатов, включая патентные документы. Мы обнаружили среди них большое разнообразие методологий подготовки и отсутствие стандартизированных процедур.Главный вывод нашего исследования заключается в том, что существует очевидная потребность в стандартизированных протоколах производства для получения сопоставимых результатов в клинических испытаниях во всем мире.

Ключевые слова: Инфекции дыхательных путей (ИРО), иммуномодулятор, бактериальные лизаты, механические, щелочные, бактериофаги, вакцина

Введение

Инфекции дыхательных путей (ИРО), такие как острый бронхит, внебольничная пневмония (ВП) и другие являются наиболее распространенными инфекционными заболеваниями людей и вызывают миллионы смертей ежегодно во всем мире (Всемирная организация здравоохранения, 2017).Кроме того, респираторные инфекции являются основным сопутствующим фактором хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ). Хотя за последние пару десятилетий были достигнуты значительные улучшения в лечении и контроле за бременем этих инфекций, все еще отсутствует вакцина против большинства инфекционных агентов, вызывающих ИРО; поэтому необходимо разработать другие профилактические стратегии (Cazzola et al., 2008; Esposito et al., 2018). Одной из стратегий лечения этих инфекций является использование бактериальных лизатов (BL), которые были введены в 1970-х годах в качестве пероральных вакцин для профилактики и лечения ИРО (Cazzola et al., 2012а; Hancock et al., 2012; Эспозито и др., 2018). Эти лизаты представляют собой смеси антигенов, происходящих от инактивированных патогенов, часто участвующих в ИРО.

За последние несколько десятилетий к БЛ вновь обратилось внимание из-за их вклада в сокращение рецидивов ИРО в детстве (Gutiérrez-Tarango and Berber, 2001; Rozy and Chorostowska-Wynimko, 2008; Navarro et al., 2011). Сообщалось также о положительных результатах лечения хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) у взрослых (Cazzola et al., 2012b; Kearney et al., 2015). Исследования показали, что BL являются эффективными иммуностимуляторами, вызывая специфические реакции в локальных областях иммунной системы слизистой оболочки (Braido et al., 2007, 2011; Cazzola et al., 2012b; Kearney et al., 2015).

Несмотря на широкое клиническое использование BL, их влияние на иммунную систему известно лишь частично. Данные большинства исследований показывают, что BL действуют как иммуномодуляторы, способные индуцировать антитела против определенных патогенов, а также иммунорегуляторные реакции в тканях слизистой оболочки (Braido et al., 2011; Cazzola et al., 2012b; Kearney et al., 2015; Эспозито и др., 2018; Triantafillou et al., 2019). В частности, было продемонстрировано, что они могут взаимодействовать с различными клетками через компоненты бактериальной стенки, такие как протеогликаны или липополисахариды, которые взаимодействуют с Toll-подобными рецепторами (TLR) на моноцитах / макрофагах, дендритных или эпителиальных клетках. Эти взаимодействия стимулируют дифференцировку моноцитов в макрофаги и активируют незрелые дендритные клетки, что приводит к выработке выбранных хемокинов и цитокинов.В целом, эти ответы будут вызывать привлечение врожденных эффекторных клеток к участкам слизистой оболочки и индуцировать активацию лимфоцитов, которая может помочь в защите от вторжения патогенов. Некоторые авторы предполагают, что эти реакции действительно создают состояние «предварительной готовности» против инфекции (Kearney et al., 2015).

Отсутствие стандартизованных протоколов может быть препятствием для экспериментальной воспроизводимости иммуностимулирующих эффектов. Разные авторы работали с разными фракциями клеток микроорганизмов в качестве компонентов BL.В частности, различные методы, с помощью которых были приготовлены лизаты, могли способствовать несоответствию между их зарегистрированными биологическими эффектами. Возможно, отсутствие строгости в дизайне эксперимента, недостаточное количество пациентов или другие технические недостатки привели к некоторому уровню недоверия к проведенным клиническим испытаниям (Cazzola et al., 2008). Стандартизированные производственные протоколы были бы полезным шагом на пути к преодолению некоторых текущих трудностей, связанных со сравнением биологических эффектов BL.

Двумя наиболее распространенными методами, используемыми для лизиса бактерий, являются щелочная обработка и механическое разрушение, хотя также использовались тепло или детергенты (Bauer et al., 2008; Braido et al., 2011; Cazzola et al., 2012a). Щелочной лизис может вызывать денатурацию белков бактериальных антигенов, тогда как механическое разрушение предположительно не изменяет антигенные структуры в BL (Kearney et al., 2015; Jurkiewicz and Zielnik-Jurkiewicz, 2018; Triantafillou et al., 2019). Каждый бактериальный штамм выращивают независимо, собирают, инактивируют выбранной процедурой и затем необязательно лиофилизируют.Индивидуальные лизаты смешивают в фиксированных пропорциях, чтобы получить поливалентный BL.

Коммерческие поливалентные бактериальные лизаты доступны в форме пероральных капсул или сублингвальных таблеток (; European Medicines Agency, 2019). Среди наиболее известных — Бронхо-Ваксом® в качестве примера бактериального иммуностимулятора, полученного путем химического лизиса, и Исмиген® или Рибомунил-D 53, состоящий из неизмененных антигенных частиц, полученных путем механического разрушения клеток (Braido et al., 2007; Cazzola et al. ., 2008). Другие коммерчески доступные БЛ используются для лечения других инфекций, таких как инфекции мочевыводящих путей (Huber et al., 2000; Бауэр и др., 2002, 2015; Азиминия и др., 2019; Wawrysiuk et al., 2019) или при рецидиве туберкулеза (Дячик, 2006), также с хорошими результатами.

Таблица 1

Характеристики и клинические результаты коммерческих бактериальных лизатов, используемых для лечения ИРО.

Бактериальный лизат	Бактериальный состав	Метод приготовления	Введение / состав	Клинические результаты
Broncho-Vaxom (Broncho-Vaxom)	С.aureus , S. pneumoniae , S. pyogenes , S. viridans , M. catarrhalis , H. influenzae , K. pneumoniae , K. ozaenae	Щелочной лизис	Капсулы для перорального применения	В педиатрии: Снижение частоты ИРО (Jara-Pérez and Berber, 2000; Gutiérrez-Tarango and Berber, 2001; Schaad, 2010; Esposito et al., 2014) . Сокращение продолжительности ИДТ (Jara-Pérez and Berber, 2000; Gutiérrez-Tarango and Berber, 2001). Снижение потребности в антибиотиках (Jara-Pérez and Berber, 2000; Gutiérrez-Tarango and Berber, 2001; Esposito et al., 2014; Chen et al., 2017). Снижение частоты приступов риносинусита (Chen et al., 2017). У пациентов с ХОБЛ: Снижение частоты обострений (Solèr et al., 2007; Tang et al., 2015). У ВИЧ-положительных пациентов: Снижение частоты ИРО и использования антибиотиков (Capetti et al., 2013).
Liuvac LW50020	S.aureus , S. pneumoniae , S. pyogenes , S. mitis , M. catarrhalis , H. influenzae , K. pneumoniae	Щелочной лизис	Таблетки для приема внутрь	В педиатрии: Снижение частоты и продолжительности ИРО, а также потребности в антибиотиках (Ruah et al., 2001). У взрослых: — Уменьшение количества и продолжительности ИРО и потребности в антибиотиках (Grevers et al., 2000). — Уменьшение количества бактерий у колонизированных пациентов (Zagólski et al., 2015).
Ismigen PBML	S. aureus , S. pneumoniae , S. pyogenes , S. viridans , M. catarrhalis , H. influenzae , K. pneumoniae , K. ozaenae	Механический лизис	Сублингвальные таблетки	В педиатрии: Снижение заболеваемости ИРТ (Rosaschino and Cattaneo, 2004). У пациентов с ХОБЛ: Уменьшение количества дней с повышением температуры тела, госпитализация (Braido et al., 2015), уменьшение количества и интенсивности обострений (Ricci et al., 2014; Braido et al., 2015).
Lantigen B	S. aureus , K. pneumoniae , S. pneumoniae , H. influenzae , M. catarrhalis , S. pyogenes	Щелочной лизис	Капли для перорального применения	Снижение количества острых эпизодов у пациентов с рецидивирующими ИРО (Braido et al., 2014).
Рибомунил D53	K. pneumoniae , S. pneumoniae , S. pyogenes , H. influenzae	Протеогликаны и рибосомы	Пероральные таблетки или гранулы	В педиатрии: Сокращение продолжительности инфекционных эпизодов (Mora et al., 2002; Fiocchi et al., 2012). Снижение заболеваемости ИРО (Mora et al., 2002).

Типы бактериальных лизатов

Щелочные бактериальные лизаты

Щелочной лизис использует ионы гидроксида натрия для разрушения структуры клеточной мембраны за счет изменения pH в пределах 11.5–12,5.

Одним из первых бактериальных лизатов, полученных щелочной экстракцией, был Lantigen B, чьи эффекты in vivo и были впервые описаны в 1970-х годах (Tyrrell et al., 1972) и недавно продемонстрированы Braido et al. (2014). Позже Bauer et al. (1995) запатентовали другой процесс, который включал культивирование Escherichia coli в водной среде с последующей щелочной экстракцией бактериальных белков в присутствии «разбавленного водного источника ионов ОН-». Используемый процесс щелочного лизиса включал концентрирование, ультрафильтрацию, диафильтрацию лизата и лиофилизацию.Авторы далее описали экстракцию липополисахаридов (LPS) с помощью ионообменной хроматографии и характеристику лизата с помощью биохимических анализов аминокислот, рацемизированных во время щелочной экстракции. Кроме того, в патент включены другие процессы лизиса бактерий, вызывающих ИРТ, с изменением концентраций гидроксида натрия (NaOH) (; Bauer et al., 1995).

Таблица 2

Методы приготовления бактериальных лизатов.

Метод лизиса	Бактериальный состав	Лизис (Время ч)	Лизис (Темп)	Используемые биохимические методы анализа лизата	Литература
Щелочной NaOH (конц) 0.01–1%	E. coli	Несколько	30–45 ° C	Ультрафильтрация Диафильтрация	Экстракция LPS (Triton X-114) Ионообменная хроматография Рацемизация аминокислот	Bauer et al., 1995
Щелочной NaOH (конц) 0,1–1,2 N	S. aureus, M . catarrhalis, K . pneumoniae, S . pneumoniae, H . influenzae	от 20 до 40	от 30 до 60 ° C	Центрифугирование Фильтрация Ультрафильтрация	Измерения белков, глутаминовой кислоты и ЛПС	Bauer et al., 2008
Механический Ультразвуковая обработка	S. aureus, M . catarrhalis, K . pneumoniae, S . pneumoniae, H . influenzae	Переменная	от 55 до 65 ° C	Лиофилизация	Определение оптической плотности	Illiarten, 1971
Mecanical Клапан высокого давления	S. aureus, M . catarrhalis, K . pneumoniae, S . pneumoniae, H . influenzae	Не упоминается	Не упоминается	Промывка, фильтрация, центрифугирование, лиофилизация	Метод анализа по Граму Ракетный электрофорез	Мелиоли и Фасани, 2004 г.
Обработка ультразвуком	S. pneumoniae, M. catarrhalis, K . pneumoniae , Micrococcus spp , H.influenzae, Streptococcus spp. (т.е. S. anhemoliticus и S. viridans ).	26	Циклы Нагревание при 70 °, выдержка при 4 ° Дополнительный цикл 70 ° C	Без упоминания Частично частное приготовление	Без упоминания	Coviello et al., 2014
Рибосомные лизаты Гомогенизатор высокого давления	S.pneumoniae, S. pyogenes, K.pneumoniae, H.influenzae, протеогликан K. pneumoniae	—	Низкая температура	Центрифугирование Фильтрация, стерилизация	Не упоминается	Michel et al., 1978
Бактериофаги	S. aureus, K. pneumoniae, P. aeruginosa .	Инкубация 3–48 часов		Фильтрация, лиофилизация	SDS-гель-электрофорез	Pillich and Balcarek, 2011

Бауэр и другие сотрудники запатентовали годы спустя бактериальный экстракт для респираторных инфекций с кратким описанием процесс его приготовления.Это был щелочной лизат, выделенный из штаммов бактерий Staphylococcus aureus, Moraxella catarrhalis, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae и Haemophilus influenzae (Bauer et al., 2008, 2010). Процесс лизирования, описанный в патенте, охватывал ряд разнообразных возможных условий на разных стадиях процесса от ферментации бактерий до полученной модифицированной белковой смеси. По мнению авторов, щелочной лизис каждого штамма или набора штаммов подходит для всех бактерий, вызывающих ИРО.

Среди имеющихся в продаже составов, полученных щелочным лизисом, есть OM-85 BV (Broncho-Vaxom®) и Liuvac (LW-50020). OM-85 BV (Broncho-Vaxom®) представляет собой смесь H. influenzae, S. pneumoniae, K. pneumoniae, Klebsiella ozaenae, S. aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridans и M. catarrhalis . Лювак представляет собой смесь бактериальных лизатов из S. aureus, S. pneumoniae, S. pyogenes, K. pneumoniae, M. catarrhalis и H. influenzae , которая также была оценена для лечения хронического бронхита и ХОБЛ ( Cazzola et al., 2008, 2012b; Эспозито и др., 2018).

Для составов бактериальных лизатов товарных знаков, таких как OM-85 BV (Broncho-vaxom®), нет доступа к подробному протоколу приготовления, в котором указываются, например, концентрации NaOH, температуры или периоды, используемые для процесса лизиса клеток.

Механические бактериальные лизаты

Наиболее широко используемые механические методы лизиса бактериальных клеток — это ультразвуковая обработка и гомогенизация под высоким давлением. Для гомогенизации используются разные давления в зависимости от типа клеток (Goldberg, 2008).

В одном из первых патентов на механическое получение бактериального лизата, обнаруженных в литературе, сообщалось об использовании высушенных и частично лизированных бактериальных антигенов (Illiarten, 1971). Автор описал лизис S. aureus, K. pneumoniae, Haemophilus influenzae, S. pneumoniae и M. catarrhalis путем медленного замораживания с последующим быстрым оттаиванием суспензии клеток в разных диапазонах температур с обработкой ультразвуком в течение разных периодов. времени ().

Melioli и Fasani запатентовали механически лизируемый препарат S.aureus, K. pneumoniae, S. pneumoniae, Haemophilus influenzae и M. catarrhalis , отдельно или в комбинации (Melioli and Fasani, 2004). Бактериальные лизаты в виде частиц получали путем фрагментации бактериальных клеток с использованием клапана высокого давления с последующим отделением неизмененной фракции антигенных частиц от растворимых компонентов центрифугированием, промывкой и фильтрацией ().

Позже Coviello et al. (2014) описали механически полученные лизаты из S.pneumoniae, M.catarrhalis, K. pneumoniae, Micrococcus spp, Haemophilus influenza и Streptoccocus spp. (например, Streptococcus anhemoliticus и S. viridans ) с помощью обработки ультразвуком для разрушения стенок бактериальных клеток. В их конкретном процессе лизиса бактериальный материал подвергался циклам изменений температуры перед тем, как лизат был проанализирован, чтобы подтвердить, что не осталось никаких жизнеспособных организмов (; Coviello et al., 2014).

Самым крупным представителем на рынке препаратов механических лизатов является Ismigen®, который представляет собой поливалентный механический бактериальный лизат (PMBL), состоящий из лизатов из S.aureus, S. pyogenes, S. viridans, K. ozaenae, H. influenzae тип b , M. catarrhalis и S. pneumoniae .

Другой тип механических лизатов — это лизаты, богатые рибосомами. Их получают путем разрушения клеток микростеклянными шариками в гомогенизаторе, методика, впервые описанная в 1965 году (Youmans and Youmans, 1965). Эти авторы показали, что рибосомная фракция, полученная из разрушенных микобактерий, проявляла высокую иммуногенность. С тех пор различные авторы изучали защиту животных с использованием рибосомных фракций бактерий, таких как S.pneumoniae, Salmonella Typhimurium и Neisseria meningitidis (Томпсон и Снайдер, 1971; Веннеман и Берри, 1971; Томас и Вайс, 1972; Свендсен и Джонсон, 1976). Затем Мишель и др. (1978) описали препарат рибосом, экстрагированный из бактериальной биомассы после бактериальной ферментации с последующим механическим разрушением под давлением при низкой температуре, серию центрифугирования для удаления целых клеток и несколько этапов фильтрации и стерилизации для получения бактериального лизата (; Michel et al., 1978). Позже Dussourd d’Hinterland и его коллеги продали интраназальную поливалентную рибосомную вакцину для людей под названием Ribomunyl-D 53, состоящую из рибосомных препаратов из K. pneumoniae, S. pneumoniae, S. pyogenes группы A и Haemophilus influenzae , с мембранный протеогликан некапсулярного штамма K. pneumoniae в качестве адъюванта (Dussourd d’Hinterland et al., 1980). Было проведено несколько исследований, показывающих его эффективность в качестве иммуностимуляторов (Lauener, 1994; Clot, 1997; Caliot et al., 2000; Bellanti et al., 2003; Буске и Фиокки, 2006). По сравнению со щелочными бактериальными экстрактами, такими как OM85 BV, было показано, что D53 индуцирует больше клеток, продуцирующих антитела, в миндалинах леченных детей, и авторы предположили, что частично транскрибируемые белки, присутствующие в обогащенном рибосомами препарате, могут содержать мощные эпитопы, которые будут взаимодействовать с иммунокомпетентными клетками. более эффективно, чем крупные белки, присутствующие в бактериальном экстракте (Béné et al., 1993).

В целом, механическое разрушение клеток оказалось эффективным методом, обеспечивающим лизис 80–100% бактерий (Cazzola et al., 2012а). Как ранее предлагали другие авторы, механические лизаты содержат частицы, которые сохраняют некоторые свойства интактных антигенных молекул, тем самым обеспечивая лучшее взаимодействие с Toll-подобными рецепторами, что является одной из первоначальных целей этих препаратов (Villa et al., 2010; Cazzola et al. ., 2012a, b; Esposito et al., 2018; Triantafillou et al., 2019). Однако этот способ имеет ограничение тепловыделения, которое необходимо минимизировать, чтобы избежать денатурализации белка в процессе, и он более дорог, чем щелочной лизис.

Препараты бактериальных лизатов с помощью бактериофагов

Бактериальные лизаты, полученные путем заражения бактерий выбранными бактериофагами, были запатентованы в 2011 году Пиллихом и Балкареком, которые работали с бактериальными лизатами с 2003 года (Pillich and Balcarek, 2011). Первоначальная идея восходит к 1917 году, когда использование бактериофагов для лечения бактериальных заболеваний было предложено D ‘Herelle (Fruciano and Bourne, 2007).

Авторы приготовили лизаты бактерий из штаммов S.aureus, K. pneumoniae и Pseudomonas aeruginosa . Они инкубировали бактериофаги с бактериальной культурой в течение определенного периода. Полученные лизаты, содержащие клеточные материалы, такие как компоненты клеточной стенки, клеточные мембраны, белки, рибосомные фракции, гликопротеины, ДНК и РНК, затем фильтровали и стерилизовали. Авторы предположили, что использование бактериофагов эффективно против всех видов бактерий.

Поскольку протокол запатентован, авторы не предоставили конкретных подробностей о времени инкубации или дозах бактериофагов.Тем не менее, приводится приблизительная концентрация культуры бактериофагов, а также приблизительное время инкубации (от 3 до 48 часов). Методы, используемые для определения антигенного паттерна, приведены в (Rothbard et al., 2014).

Клинические эффекты

Было проведено множество клинических исследований для оценки иммуностимулирующего эффекта бактериальных лизатов, оцениваемого как положительное воздействие на пациентов, восприимчивых к инфекциям дыхательных путей (ИРО) в детском, пожилом возрасте или пациентов с ХОБЛ.Среди всех бактериальных лизатов, описанных в литературе, наибольшее количество клинических испытаний было выполнено на OM-85 BV (Broncho-vaxom®) и Ismigen® (PMBL) в качестве примеров химического или механического лизиса соответственно (Bessler et al., 2010; Navarro et al., 2011; Lanzilli et al., 2013; Tang et al., 2015).

OM-85 показал хорошую безопасность и переносимость во многих исследованиях с уменьшением рецидивов респираторных инфекций у детей и взрослых (Jara-Pérez and Berber, 2000; Gutiérrez-Tarango and Berber, 2001; Solèr et al., 2007; Шаад, 2010). Метаанализ восьми рандомизированных контролируемых исследований, проведенных Schaad et al., Показал снижение случаев рецидивов ИРО среди детей, получавших OM-85 (Schaad, 2010). Затем другой метаанализ также подтвердил эти данные и показал защитный эффект ОМ-85 при рецидивирующих ИРО у детей (Yin et al., 2018; Esposito et al., 2019). Что касается пациентов с ХОБЛ, метаанализ, опубликованный Pan et al., Пришел к выводу, что имеющихся данных недостаточно для подтверждения положительного эффекта OM-85BV у пациентов с ХОБЛ с точки зрения продолжительности госпитализации, тяжести обострения и общего количества побочных эффектов. (Пан и др., 2015).

В целом авторы согласны с тем, что среди уже проведенных испытаний есть некоторые ограничения, поэтому существует необходимость в высококачественных, больших, многоцентровых, двойных слепых, плацебо-контролируемых рандомизированных клинических испытаниях, чтобы подтвердить роль иммуностимуляторов. в профилактике ИРО у детей (Del-Rio-Navarro et al., 2012), а также взрослых или пациентов с ХОБЛ (Pan et al., 2015).

С другой стороны, существует также много клинических исследований с использованием BL, полученных механическим разрушением, показывающих многообещающие результаты.Rosaschino и Cattaneo (2004) оценили эффективность и переносимость у педиатрических пациентов, получавших PMBL, и продемонстрировали, что лечение было эффективным при отличной переносимости BL (Rosaschino and Cattaneo, 2004). Брейдо и Мелиоли изучали другой препарат лизата, названный Лантиген В, у пациентов с рецидивирующими ИРО и продемонстрировали значительное снижение количества острых эпизодов у этих пациентов (Braido et al., 2014).

Результаты активности BL в качестве вакцины были описаны как частично зависящие от используемого патогенного штамма, частично (в случае рибосомных BL) от степени чистоты субклеточной фракции и частично от присутствия или отсутствия других клеток. составляющие, такие как полисахариды (Michel et al., 1978). Различные типы иммунных ответов (клеточно-опосредованные или гуморальные) были вызваны в разных исследованиях. Пути введения включают назальный, сублингвальный, а также оральный (Schaad, 2010; Cazzola et al., 2012a; Rial et al., 2016).

Таким образом, несколько исследований показали положительный эффект лечения бактериальными экстрактами, полученными с помощью механических или химических процедур. Как уже упоминалось, некоторые авторы заявили, что механическое разрушение может быть лучшей альтернативой химическому лизису из-за сохранения антигенов.Однако не проводилось исследований, сравнивающих биологические эффекты поливалентных бактериальных лизатов, приготовленных из тех же бактериальных культур, но с использованием механических или химических процедур лизата (механических или химических). Эти сравнительные исследования могут пролить свет на выбор лучшего метода приготовления лизатов иммуностимуляторов.

Перспективы на будущее

В течение многих лет использовалось несколько методов для приготовления клеточных лизатов (например, щелочная обработка или механическое разрушение).Поскольку механическое разрушение считается наиболее перспективным способом лизиса клеток, некоторые компании достигли значительного технологического прогресса в этой области (Cazzola et al., 2012a; Jurkiewicz and Zielnik-Jurkiewicz, 2018; Esposito et al., 2019 ). Они разработали сфокусированную ультразвуковую обработку, передовую технологию с компьютерным управлением, которая может контролировать дозировку энергии, доставляемой для мягкого разрушения клеточных мембран клеток млекопитающих или внезапного разрушения клеточных стенок бактерий. Эта технология может решить проблемы стандартизации процедур получения механических бактериальных лизатов (Wenger et al., 2008; Bláha et al., 2017).

Профилактика инфекций дыхательных путей с помощью бактериального лизата бронхомунала ОМ-85 у детей и взрослых: современное состояние | Междисциплинарная респираторная медицина

Инфекции дыхательных путей (ИРО) представляют собой широко распространенную проблему со здоровьем как у взрослых, так и у детей и влекут за собой высокие экономические затраты во всем мире. На сегодняшний день идентифицированы два основных типа клинически значимых ИРО: острые обострения при хроническом бронхите или хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) и рецидивирующие инфекции дыхательных путей (ИРО).

ИРО поражают как верхние, так и нижние дыхательные пути и могут быть вызваны широким спектром микроорганизмов. Примитивная причина заболевания обычно вирусная и определяется инфекциями вирусов гриппа и парагриппа, респираторного вируса, аденовируса, риновирусов [1]. С другой стороны, рецидивирующие ИРО могут быть вызваны различными типами бактерий, включая Acinetobacter spp. ., Chlamydia pneumoniae , Enterobacteriacee , Haemophilusinfluenzae , Legionella xpluenzae , Legionella pneumophila. Mycoplasma pneumoniae , Nocardia asteroids , Pasteurella multocida , Pseudomonas aeruginosa , Staphylococcus aureus , Stenotrocusphomonasmaltophilia Streptocococococ, .

Убедительные данные эпидемиологических исследований показывают, что ИРО на сегодняшний день являются основной причиной заболеваемости и смертности среди детей. Согласно отчету Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) за 1998 год, острые респираторные инфекции нижних дыхательных путей являются причиной 19% всех смертей среди детей в возрасте до 5 лет, и только в 2000 году они стали причиной 1,9 миллиона смертей среди детей (95% ДИ 1,6- 2,2 млн), 70% из которых приходится на Африку и Юго-Восточную Азию [2]. Более того, несколько исследований показали, что такие инфекции возникают чаще, если они связаны с такими факторами предрасположенности, как воздействие табачного дыма [3], загрязнение воздуха в помещении [4], отсутствие грудного вскармливания [5] и посещение детских садов [ 6].

Частота инфекций уменьшается с ростом , но средний уровень инфицирования среди взрослых остается два раза в год. У взрослых наиболее распространенным хроническим респираторным заболеванием является ХОБЛ [7], при котором респираторные вирусы и бактериальные сопутствующие инфекции могут быть обычными [8], а бактериальные инфекции, как сообщается, связаны с 50% обострений [9]. Вирусные инфекции, которые могут вызвать острый бронхит у здоровых людей, являются одной из основных причин обострений у пациентов с ХОБЛ.В прошлом важность вирусных инфекций в этиологии обострений в значительной степени недооценивалась и, вероятно, способствовала плохому результату лечения некоторыми антибиотиками [8].

Одним из традиционных терапевтических подходов к профилактике и лечению ИРО является прием антибиотиков. Однако с годами их эффективность серьезно снизилась (вероятно, из-за частого и неправильного употребления антибиотиков, которое изменило восприимчивость обычных респираторных патогенов к антибиотикам), что снизило пользу для пациента.

В последние годы было четко установлено экономическое бремя ИРО для общества: фармакологические затраты, связанные с облегчением симптомов и предотвращением осложнений, расходы, связанные с потерей рабочих дней, поиском помощи у терапевта, госпитализацией, родителями. отпуск, другие факторы и, конечно, расходы на здравоохранение.

С учетом текущих эпидемиологических и социально-экономических данных, указывающих на необходимость использования альтернативных подходов к антибиотикотерапии, используемых сегодня, целью данного исследования является обсуждение одного из самых традиционных фармакологических вмешательств для лечения ИРТ и ХОБЛ, бактериальных лизатов.В частности, в данной обзорной статье основное внимание будет уделено иммуномодулятору ОМ-85 и его применению в основных клинических исследованиях, проведенных в последние годы. Также будут представлены результаты основных систематических обзоров.

Иммуномодуляция бактериолизатом OM-85

Один из функциональных и безопасных подходов к профилактике и лечению острых (ОРТИ) и рецидивирующих (ИРП) инфекций дыхательных путей — неспецифическое усиление иммунного ответа или усиление врожденных защитных механизмов организма.Это может быть достигнуто с помощью бактериальных лизатов, которые представляют собой смеси бактериальных антигенов, полученных из различных инактивированных патогенных микробов. Антигены получают путем химического или механического лизиса микроорганизмов и их лиофилизированного экстракта, полученного из культивируемых штаммов бактерий, часто присутствующих в дыхательных путях.

OM-85 BronchoMunal® представляет собой бактериальный иммуностимулятор, полученный путем химического лизиса G + и G- микроорганизмов, часто ассоциированных со многими респираторными инфекциями, а именно Haemophilusinfluenzae , Branhamellacatarrhalis , Kletociellapneumoniae 917occlepneumoniae 917occusa 917 , Streptococcus pyogenes , Streptococcus viridans и Staphylococcus aureus .Лиофилизированный экстракт вводится перорально и содержит белки, пептиды и следы жирных кислот сахаров, липоитейхоевых кислот и детоксифицированных липополисахаридов. Педиатрический состав OM-85 содержит 3,5 мг бактериального экстракта, а состав для взрослых 7 мг. Основные этапы, через которые проходит ОМ-85 при приеме, показаны на рисунке 1.

Рисунок 1

Пять этапов, через которые проходит ОМ-85, от его поступления до образования антител в слизистых оболочках дыхательных путей. OM-85, в отличие от типичных вакцин, которые вводятся парентерально, вводится перорально — педиатрическая капсула, содержащая 3,5 мг лиофилизированного экстракта и 7 мг для взрослых. В кишечнике лиофилизированные бактерии достигают пейеровских пятен (1). В этой реактивной лимфоидной ткани дендритные клетки примированы, тем самым активируя лимфоциты и Т- и В-клетки, последние из которых будут продуцировать антитела (2). Затем иммунные клетки транспортируются с лимфой в мезентериальные лимфатические узлы для созревания (3).Активированные иммунные клетки достигают слизистой оболочки дыхательных путей (4) и стимулируют врожденную и адаптивную иммунную систему, а также выработку секреторных антител IgA в слизистой оболочке дыхательных путей (5).

Защитные эффекты бактериального OM-85 в основном обусловлены его модулирующей ролью как в клеточных, так и в гуморальных реакциях. В частности, недавние открытия предполагают, что иммунопротекторные эффекты OM-85 опосредованы стимуляцией клеточного ответа Th2 [10] и индукцией синтеза иммуноглобулина (Ig), в основном IgA, B-клетками.

Параллельно своему влиянию на клеточный ответ OM-85 также повышает врожденный иммунитет в легких, стимулируя активность фагоцитов, тем самым увеличивая разрушение вторгающихся патогенов [11].

Были предложены различные механизмы, с помощью которых ОМ-85 стимулирует фагоцитарные клетки. Mauel et al. показали, что бактериальные иммуномодуляторы усиливают респираторный выброс — выработку супероксида и нитрита — альвеолярными макрофагами, тем самым повышая микробицидную и цитолитическую активность [12].Более того, экспериментальные данные показали, что OM-85 увеличивает экспрессию молекул адгезии [13] и что CD-14-независимый путь запускает активацию фагоцитов. Основные механизмы действия OM-85 приведены на Рисунке 2.

Рисунок 2

Механизм действия OM-85 [ [11] ] . Ig, иммуноглобулин; INF-γ, Интерферон γ; ИЛ, интерлейкин; Th2, NO, оксид азота; Т-хелперные клетки 1 типа; Th3: вспомогательная Т-клетка 2 типа.

Иммуностимулирующие компоненты OM-85, а именно: порин, муреин и N-концевая часть липопротеина [14], вероятно, активируют врожденную иммунную систему, связывая toll-подобные рецепторы (TLR), и в соответствии с механизмом-зависимым на сигнальный адаптерный белок TLR MyD88 [10, 15, 16].

Доказательства эффективности и безопасности ОМ-85 у детей

Повышение как специфического, так и неспецифического иммунного ответа считается ключевым моментом при лечении ИРП.

В этом отношении эффективность OM-85 в укреплении иммунной системы и сокращении количества ИРО была исследована в нескольких клинических испытаниях и проанализирована в систематических обзорах (Таблица 1).

Таблица 1 Описание включенных клинических исследований, проведенных на детях

Большинство рандомизированных двойных слепых плацебо-контролируемых клинических испытаний, проведенных у детей с ИРО, продемонстрировали эффективность и безопасность OM-85.

В 1993 году Collet et al. изучили эффект лечения ОМ-85 у 423 детей дневного ухода (от 6 до 36 месяцев) [17]. В то время как риск ≥ 4 ИРО в конце периода наблюдения не был значительно ниже в активной группе по сравнению с плацебо, наблюдалось 48% -ное снижение риска появления ≥ 3 эпизодов инфекций верхних дыхательных путей в 3 случаях. -месячный период лечения в обработанной группе.

ИРО часто являются причиной пропуска школьных дней у детей от 6 до 13 лет: в элегантном исследовании Jara-Perez et al.продемонстрировали профилактический эффект ОМ-85 при острых ИРО (ОРВИ) у 200 девочек, живущих в приюте, группы детей, особенно подверженных микробному заражению и, следовательно, ИРОТ [18]. В конце испытания среднее количество ОРТИ в активной группе составляло 1,0 (0,0-3,0, 5-й и 95-й процентиль), тогда как в группе, получавшей плацебо, оно составляло 3,0 (2,0-5,0, 5-й и 95-й процентиль) (p < 0,05). Более того, авторы показали, что лечение ОМ-85 значительно сокращает количество пропущенных учебных дней, курсов антибиотиков и продолжительность заболевания (p <0.001) по сравнению с группой, получавшей плацебо.

Эффективность профилактики ИРО у детей дошкольного и школьного возраста была подтверждена исследованием Gutiérrez-Tarango et al. [19]. В этом исследовании, помимо уменьшения количества и продолжительности ИРО в активной группе по сравнению с плацебо (среднее ± стандартное отклонение: 5,04 ± 1,99 против 8,0 ± 2,55 соответственно), авторы наблюдали значительное снижение количества антибиотиков. курсы (p <0,001 в обоих случаях).

По данным Schaad et al., Лечение OM-85 снижает частоту возникновения ОРТИ также в популяции детей с рецидивирующими ОРВИ в возрасте 3–8 лет.[20]. OM-85 значительно снизил среднюю частоту ИРТ верхних отделов на 16% в активной группе (p <0,05 по сравнению с группой плацебо). Различия между двумя группами увеличились в течение 5-месячного периода лечения и немного уменьшились в течение месяца наблюдения. Снижение ИРТ в верхних отделах в этом исследовании, хотя и значительное, менее выражено, чем сообщалось Jara-Perez et al. И Gutierrez et al. Однако в последних исследованиях участвовали дети, живущие в детском доме [18] и в районе с высоким уровнем загрязнения [19].Эти параметры связаны с высокой восприимчивостью к ИРТ и, опять же, позволяют предположить, что эффективность OM-85 BV более очевидна у пациентов, особенно чувствительных к ИРО.

Несмотря на то, что увеличение частоты обострений, вызванное инфекционными агентами, является важным исходом у детей с хрипом и астмой, оно обычно включается в число критериев исключения в педиатрических клинических испытаниях, и данные по этому вопросу немногочисленны. Однако клиницисты ищут более подходящие методы лечения, особенно в связи с накоплением данных о том, что обратимость тяжелых атопических заболеваний снижается с течением времени от начала [21].Современные методы лечения, включая ингаляционные кортикостероиды, имеют ограниченную эффективность в предотвращении спровоцированных вирусами приступов свистящего дыхания у маленьких детей. Таким образом, у детей с приступами свистящего дыхания, вызванными ИРО, настоятельно необходимы стратегии первичной и вторичной профилактики. Эффективность ОМ-85 для уменьшения приступов свистящего дыхания была протестирована Razi et al. у 75 дошкольников [22]. В этом хорошо проведенном рандомизированном двойном слепом исследовании авторы продемонстрировали снижение на 37,9% количества приступов свистящего дыхания у пролеченных пациентов по сравнению с плацебо (p <0.01), указывая на то, что OM-85 является эффективной вторичной профилактической стратегией у детей с приступами хрипов, вызванными ИРО, как атопическими, так и нет. Несмотря на то, что результаты клинических исследований OM-85 для предотвращения ИРО у детей с астмой и атопией обнадеживают, необходимы дальнейшие хорошо спланированные рандомизированные исследования астмы.

Предыдущие исследования показали, что OM-85 увеличивает уровни секреторного IgA [23], сывороточного IgA [24], сывороточного IgG и сывороточного IgM [25] у взрослых.

Однако небольшое рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое клиническое исследование, проведенное у детей с ИРТ [26], интересно показало значительное снижение уровней подкласса IgG4 после лечения OM-85.Поскольку активная роль подкласса IgG4 была продемонстрирована в реакции гиперчувствительности I типа, эти данные, по-видимому, позволяют сделать вывод о том, что дополнительная терапия с помощью ОМ-85 может быть полезной для уменьшения ИДП у детей с аллергическими заболеваниями дыхательных путей.

Антигенный эффект OM-85 был протестирован также на популяции детей с дефицитом IgA, с целью оценить, может ли OM-85 вызывать аутоиммунитет [27]. В этом 4-летнем проспективном исследовании было набрано 63 ребенка с дефицитом IgA, рецидивирующими фебрильными инфекциями и ИРО, и ОМ-85 был введен группе из 37 детей.В конце исследования частота ИРО не различалась в двух группах детей с дефицитом IgA. Однако клинические и лабораторные маркеры аутоиммунитета не наблюдались в группах, получавших и не получавших лечение.

Общий эффект OM-85 BV при лечении ИРТ изучался также в систематических обзорах. В систематическом количественном обзоре 13 клинических испытаний (2721 пациент) с тестированием OM-85 Steurer-Stey et al. обнаружили слабые доказательства в пользу ОМ-85 для профилактики ОРТИ у детей с тенденцией к меньшему количеству инфекций [28].

В 2010 году Schaad [29] выполнил систематический обзор, чтобы оценить эффективность OM-85 в предотвращении возникновения ИРО у детей. В исследование было включено восемь рандомизированных контролируемых испытаний (дети в возрасте 1–12 лет), и автор показал снижение на 26,2% у пациентов с ИРТ (то есть ≥3 ИРТ). Результаты этого исследования были очень разнородными, вероятно, из-за клинического и методологического разнообразия. Автор указывает, что положительная эффективность ОМ-85 была особенно заметна у детей с высоким риском ИРО.

В своем недавнем обновлении систематического обзора «Иммуностимуляторы для профилактики инфекций дыхательных путей у детей» Del Rio Navarro et al. [30, 31] показали, что среди 35 проанализированных исследований (4 060 участников, <18 лет, не страдающих астмой, аллергией, атопией или хроническими респираторными заболеваниями) в целом наблюдалось снижение ИРО на 40%. Они выдвинули гипотезу о том, что общий эффект снижения заболеваемости ОРТИ зависит от фоновой частоты ОРТИ, и пришли к выводу, что иммуномодуляторы следует назначать только детям с доказанной высокой восприимчивостью к ОРТИ [31].

Количество клинических испытаний, проанализированных только для OM-85, составило 9 (852 участника) с общим эффектом Z = 5,19 (p <0,001).

Истина в том, что оценка степени влияния ОМ-85 на снижение заболеваемости ОРТИ сдерживается расхождениями, часто из-за высокой гетерогенности исследований и низкого или среднего качества испытаний [32, 33] .

Однако на сегодняшний день несколько клинических исследований подтвердили эффективность и безопасность OM-85 BV для профилактики и лечения ИРО у детей с инфекциями различного происхождения.

Доказательства эффективности и безопасности OM-85 RV у взрослых

Швейцарские руководящие принципы указывают на использование иммуномодуляторов среди возможных терапевтических вариантов, указанных для лечения ХОБЛ у взрослых [34]. Более того, было продемонстрировано, что использование иммуностимуляторов является полезным вариантом лечения ХОБЛ в соответствии с недавней рекомендацией Глобальной инициативы по хронической обструктивной болезни легких (GOLD), совместной ВОЗ и Национальным институтом сердца, легких и крови (NHLBI) [ 35].Однако рекомендуются дополнительные рандомизированные клинические исследования для включения иммуностимуляторов в качестве регулярной терапии у пациентов с ХОБЛ.

Хронический бронхит признан основным источником заболеваемости пожилых пациентов, которые часто страдают рецидивирующими инфекциями дыхательных путей. Эффективность ОМ-85 в профилактике ИРО у пожилых пациентов была продемонстрирована в нескольких клинических исследованиях, как показано в таблице 2.

Таблица 2 Описание клинических исследований, проведенных среди взрослого населения

Orcel et al.оценили эффект OM-85 в рандомизированном контролируемом клиническом исследовании с участием 290 пожилых людей, проживающих в учреждении [36]. Введение бактериального лизата было связано с 28% уменьшением числа пациентов с более низкими ИРТ (p <0,05), что было связано с уменьшением количества эпизодов острого бронхита на 40% (p <0,01). Авторы также наблюдали общее сокращение назначений антибиотиков в группе лечения по сравнению с группой плацебо.

В соответствии с результатами Orcel et al.сокращение продолжительности острых эпизодов бронхита и лихорадки ранее наблюдалось Cvoriscec et al. в рандомизированном клиническом исследовании [24]. Также в этом случае лечение ОМ-85 значительно сократило продолжительность острых эпизодов бронхита (p <0,001) и потребление антибиотиков (p <0,05). Интересно, что в дополнение к клинической эффективности авторы сообщили о значительном увеличении сывороточных уровней IgA и количества Т-лимфоцитов у пациентов, получавших ОМ-85, в течение 3 месяцев после обострения, тем самым подтверждая модулирующую роль ОМ-85 в иммунная система.

Профилактическая роль ОМ-85 в уменьшении обострений у пожилых пациентов с хроническим бронхитом и ХОБЛ была подтверждена в нескольких клинических исследованиях. Collet et al. [37] изучали 191 пожилого человека с хроническим бронхитом и ХОБЛ и сообщили о снижении на 55% количества дней госпитализации и продолжительности пребывания в активной группе по сравнению с плацебо (p = 0,037).

В небольшом более позднем исследовании [38] 90 пациентов с ХОБЛ были рандомизированы для получения OM-85 или плацебо. В конце однолетнего наблюдения у пролеченных пациентов наблюдалось значительное снижение частоты, продолжительности и тяжести обострения по сравнению с группой плацебо (p <0.05 во всех случаях).

Эффективность этого иммуномодулирующего агента подтверждена Solèr et al. [39] у более молодого населения с легкой формой ХОБЛ или хроническим бронхитом. Авторы сообщили о значительно более высокой вероятности того, что пациенты, получавшие OM-85, не будут иметь обострений (p = 0,014). В частности, эффект от лечения был более значительным среди пациентов, страдающих 2 или более эпизодами обострения с момента включения в исследование, или среди курильщиков (p = 0.001).

В недавнем исследовании 384 пациента, страдающих хроническим бронхитом и ХОБЛ, были вовлечены в рандомизированное контролируемое исследование, в котором сравнивали OM-85 с плацебо при обострениях [40]. По окончании исследования частота повторных обострений в активной группе значительно снизилась (23% по сравнению с 33% в группе плацебо, p <0,05). Более того, результаты показали, что среди пациентов с обострениями количество пациентов с рецидивирующими обострениями было ниже в группе OM-85, чем в группе плацебо (38.7 против 73,1, p <0,01), и что процент введения антибиотиков был ниже в группе лечения по сравнению с группой плацебо (37,0% против 63%, p <0,05).

Эффект OM-85 был протестирован также на группе ВИЧ-положительных пациентов, группе пациентов, для которых активно проводится поиск иммуностимулирующих методов лечения. Эти пациенты имеют высокую распространенность ХОБЛ [41] и имеют высокий риск развития сезонных ИРО. В этом пилотном исследовании приняли участие 130 ВИЧ-инфицированных пациентов с высоким риском ИРО [42].ОМ-85 вводили 65 пациентам в течение первого года. Ввиду удовлетворительных результатов, полученных у этих пациентов, в следующем году лечение было распространено на всех пациентов. Было проведено сравнение количества событий в год до введения и в год после введения, в результате чего было уменьшено количество циклов антибиотиков (которое уменьшилось с 297 до 55) и госпитализаций (которое уменьшилось с 23 до 6).

Эффект орально очищенных бактериальных лизатов при хроническом бронхите и ХОБЛ был проанализирован в двух недавних систематических обзорах [28, 43].Steurer-Stey et al. проанализировали 13 исследований, в которых участвовал 1971 пациент, получавший бактериальные экстракты или плацебо [28]. Авторы не нашли достаточно доказательств, чтобы предположить, что лечение может предотвратить обострения. Однако лечение OM-85 BV привело к улучшению симптомов по оценке как наблюдателей, так и пациентов, а также к сокращению средней продолжительности обострения. В другом системном обзоре Sprenkle et al. оценили эффект и безопасность OM-85 у пациентов с ХОБЛ [43]. Авторы изучили 13 рандомизированных контролируемых исследований с участием 2066 пациентов и обнаружили незначительную тенденцию в пользу OM-85 в снижении частоты обострений, даже если профиль безопасности был хорошим.Этот результат может быть связан с высокой разнородностью данных и методологическими недостатками некоторых испытаний. Следовательно, необходимы дальнейшие более крупные высококачественные рандомизированные контролируемые испытания с участием субъектов с четко выраженной ХОБЛ для подтверждения эффективности этого агента.

Можем ли мы усилить естественную защиту человека с помощью бактериальных лизатов? | Журнал Всемирной организации по аллергии

1.

File TM: Эпидемиология инфекций дыхательных путей. Semin Respir Infect.2000, 15: 184-194. Обзор

CAS Статья PubMed Google ученый

2.

Розы А., Черостовска-Винимко Дж .: Бактериальные иммуностимуляторы — механизм действия и клиническое применение при респираторных заболеваниях. Пневмонол Алергол Пол. 2008, 76: 353-359. Обзор

PubMed Google ученый

3.

Collet JP, Shapiro P, Ernst P, Renzi T., Ducruet T., Robinson A: эффекты иммуностимулирующего агента при обострениях и госпитализации у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких.Am J Respir Crit Care Med. 1997, 156: 1719-1724.

CAS Статья PubMed Google ученый

4.

Steurer-Stey C, Bachmann LM, Steurer J, TramȲr MR: Устные очищенные бактериальные экстракты при хроническом бронхите и ХОБЛ: систематический обзор. Грудь. 2004, 126: 1645-1655.

Артикул PubMed Google ученый

5.

Schaad UB, Mɒtterlein R, Goffin H: Исследовательская группа BV-Child.Иммуностимуляция OM-85 у детей с рецидивирующими инфекциями верхних дыхательных путей: двойное слепое плацебо-контролируемое многоцентровое исследование. Грудь. 2002, 122: 2042-2049.

Артикул PubMed Google ученый

6.

Росси Г.А., Пери С., Рейнал М.Э., Дефилиппи А.С., Риссо ФМ, Шеноне Дж., Паллестрини Е., Мелиоли Г.: естественный иммунный ответ против бактерий, обычно участвующих в инфекциях верхних дыхательных путей: анализ антиген-специфических уровень IgA в слюне.Immunol Lett. 2003, 86: 85-91.

CAS Статья PubMed Google ученый

7.

Пауэлс Р., Буист А., Калверли П., Дженкинс С., Херд С.С.: Научный комитет GOLD. Глобальная стратегия диагностики, лечения и профилактики хронической обструктивной болезни легких. Итоги семинара по глобальной инициативе NHLBI / ВОЗ по хронической обструктивной болезни легких (GOLD). Am J Respir Crit Care Med. 2001, 163: 1256-1276.

CAS Статья PubMed Google ученый

8.

Мерфи Т., Сетхи С., Современное состояние: бактериальная инфекция при хронической обструктивной болезни легких. Энн Рев Респир Дис. 1992, 146: 1067-1083.

CAS Статья Google ученый

9.

Braido F, Tarantini F, Ghiglione V, Melioli G, Canonica GW: Бактериальный лизат в профилактике острого обострения ХОБЛ и респираторных рецидивирующих инфекциях. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 2007, 2: 335-345.

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

10.

Сингх К., Амдекар С., Сингх Д.Д., Трипати П., Шарма Дж., Ядав Х .: Врожденный и специфический иммунитет, связанный с кишечником, и микробное вмешательство. FEMS Immunol Med Microbiol. 2009, 55: 6-12. Epub 2008 декабрь 10. Обзор

Google ученый

11.

Brandtzaeg P: Иммунитет слизистой оболочки: индукция, распространение и эффекторные функции. Scand J Immunol. 2009, 70: 505-515. Обзор

CAS Статья PubMed Google ученый

12.

Канг Ю., Тан Л., Кэрролл М., Джентл М., Сим Р. Б.: Распознавание целевого паттерна белками комплемента классического и альтернативного путей. Adv Exp Med Biol. 2009, 653: 117-128. Обзор

CAS Статья PubMed Google ученый

13.

Джу Х, Кларк Дж., Харт Д. Н.: Обзор человеческих подтипов DC. Методы Мол биол. 2010, 595: 3-20. Просмотреть статью

PubMed Google ученый

14.

Kabelitz D, Schrder J-M, (ред.): Механизмы защиты эпителия. Chem Immunol Allergy. Базель, Каргер. 2005, 86: I-XII. Авторские права 2005 г. S. Karger AG, Базель (Швейцария)

15.

Fuggetta M, Lanzilli G: Attivazione delle risposte immmunitarie mediante Vacini batterici. Eur Respir News. 2007, 15: 69-77.

Google ученый

16.

Lanzilli G, Falchetti R, Tricarico M, Ungheri D, Fuggetta MP: In vitro эффекты иммуностимулирующего бактериального лизата на функцию лимфоцитов человека.Int J Immunopathol Pharmacol. 2005, 18: 245-254.

CAS Статья PubMed Google ученый

17.

Lanzilli G, Falchetti R, Cottarelli A, Macchi A, Ungheri D, Fuggetta MP: In vivo эффект иммуностимулирующего бактериального лизата на В-лимфоциты человека. Int J Immunopathol Pharmacol. 2006, 19: 551-559.

CAS Статья PubMed Google ученый

18.

Брайдо Ф., Тарантини Ф., Гильоне В., Мелиоли Дж., Каноника Г.В.: Бактериальный лизат в профилактике обострения ХОБЛ и респираторных рецидивирующих инфекциях. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 2007, 2: 335-345.

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

19.

Chiavaroli C, Moore A: Гипотеза, связывающая противоположные иммунологические эффекты, вызываемые бактериальным лизатом OM-89 при инфекции мочевыводящих путей и ревматоидном артрите.BioDrugs. 2006, 20: 141-149.

CAS Статья PubMed Google ученый

20.

Альянакян М.-А, Грела Ф., Ауменье А. Трансформирующий фактор роста и естественные Т-клетки-киллеры участвуют в защитном эффекте бактериального экстракта при диабете 1 типа. Сахарный диабет. 2006, 55: 179-185.

CAS Статья PubMed Google ученый

21.

Зиузио С., Саксон Б. Вакцинотерапия при лечении бактериальной аллергии носа и носовых пазух.Виад Лек. 1994, 47: 510-513.

CAS PubMed Google ученый

22.

Banche G, Allizond V, Mandras N, Garzaro M, Cavallo G и др.: Улучшение клинического ответа у пациентов с аллергическим ринитом, получавших пероральный иммуностимулирующий бактериальный лизат: иммунологические эффекты in vivo. Int J Immunopathol Pharmacol. 2007, 20: 129-138.

CAS Статья PubMed Google ученый

23.

Хайнц Б., Шлентер В.В., Кирстен Р., Нельсон К.: Клиническая эффективность Бронхо-Ваксома у взрослых пациентов с хроническим гнойным синуситом — многоцентровое, плацебо-контролируемое, двойное слепое исследование. Int J Clin Pharmacol Ther Toxicol. 1989, 27: 530-534.

CAS PubMed Google ученый

24.

Dughera L, Serra AM, Battaglia E, Tibaudi D, Navino M, Emanuelli G: Острый рецидивирующий дивертикулит можно предотвратить пероральным введением суспензии полибактериального лизата.Минерва Гастроэнтерол Диетол. 2004, 50: 149-153.

CAS PubMed Google ученый

25.

Bi-Feng Qian, Tonkonogy SL, Hoentjen F, Dieleman L, Balfour Sartor R: Нарушение регуляции люминальных бактериальных антиген-специфических Т-клеточных ответов и функции антигенпрезентирующих клеток у трансгенных крыс HLA-B27 с хроническим колитом. Иммунология. 2005, 116: 112-121.

Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

26.

Куллберг М., Андерсен Дж., Горелик П.Л., Каспар П., Суэрбаум С. и др.: Индукция колита с помощью клона CD4 + Т-клеток, специфичного для бактериального эпитопа. Proc Natl Acad Sci USA. 2003, 100: 15830-15835. Epub 2003 12 декабря

CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

27.

Hoentjen F, Welling G, Harmsen HJ, Zhang X, Snart J, et al: Уменьшение колита пребиотиками у трансгенных крыс HLA-B27 связано с изменениями микрофлоры и иммуномодуляцией.Воспаление кишечника. 2005, 11: 977-985.

Артикул PubMed Google ученый

28.

Маринова С., Ненков П., Маркова Р., Николаева С., Костадинова Р., Митов И., Вретенарская М.: Клеточные и гуморальные системные и слизистые иммунные реакции, стимулированные пероральным полибактериальным иммуномодулятором у пациентов с хроническими инфекциями мочевыводящих путей. Int J Immunopathol Pharmacol. 2005, 18: 457-473.

CAS Статья PubMed Google ученый

29.

Neumann C, ZɆnnchen B, Willershausen-ZɆnnchen B: Эффективность перорального иммуностимулятора при лечении пародонтита: пилотное исследование. Eur J Med Res. 1996, 1: 387-392.

CAS PubMed Google ученый

30.

Oehling A, Baena-Cagnani C, Neffen H: Бактериальная иммунотерапия детской бронхиальной астмы. Allergol Immunopathol (Мадр). 1980, 8: 177-184.

CAS Google ученый

31.

Sramek J, Josifko M, Helcl J, Holoubkovȥ E, Janout V, Kozesnȷk B, Macȥovȥ I: Бактериальный лизат (I.R.S. 19), применяемый интраназально для профилактики острых респираторных заболеваний у детей: рандомизированное двойное слепое исследование. J Hyg Epidemiol Microbiol Immunol. 1986, 30: 377-385.

CAS PubMed Google ученый

32.

Zagar S, Lofler-Badzek D: Broncho-Vaxom у детей с риносинуситом: двойное слепое клиническое испытание.ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 1989, 50: 397-404.

Артикул Google ученый

33.

Collet JP, Ducruet T, Kramer MS, Haggerty J, Floret D, Chomel J, Durr F: Стимуляция неспецифического иммунитета для снижения риска рецидивирующих инфекций у детей, посещающих детские сады. Исследовательская группа Epicreche. Pediatr Infect Dis J. 1993, 12: 648-652.

CAS Статья PubMed Google ученый

34.

Гомес Баррето Д., Де ла Торре С., Альварес А., Форе А., Бербер А.: Безопасность и эффективность OM-85-BV плюс амоксициллин / клавуланат при лечении подострого синусита и профилактике рецидивирующих инфекций у детей. Allergol Immunopathol (Мадр). 1998, 26: 17-22.

CAS Google ученый

35.

Ruah SB, Ruah C, van Aubel A, Abel S, Elsasser U: Эффективность поливалентного бактериального лизата у детей с рецидивирующими инфекциями дыхательных путей.Adv Ther. 2001, 18: 151-162.

CAS Статья PubMed Google ученый

36.

Гутьеррес-Таранго М., Бербер А: Безопасность и эффективность двух курсов OM-85 BV в профилактике инфекций дыхательных путей у детей в течение 12 месяцев. Грудь. 2001, 119: 1742-1748.

CAS Статья PubMed Google ученый

37.

Schaad UB, Mutterlein R, Goffin H, BV-Child Study Group: Иммуностимуляция OM-85 у детей с рецидивирующими инфекциями верхних дыхательных путей: двойное слепое плацебо-контролируемое многоцентровое исследование.Грудь. 2002, 122: 2042-2049.

Артикул PubMed Google ученый

38.

Rosaschino F, Cattaneo L: Стратегии оптимизации соблюдения педиатрических пациентов сезонной антибактериальной вакцинации с сублингвальным введением поливалентных механических бактериальных лизатов (PMBL). Acta Biomed Ateneo Parmense. 2004, 75: 171-178.

Google ученый

39.

Del-Rio-Navarro B, Luis Sienra-Monge JJ, Berber A, Torres-Alcȥntara S, Avila-Castan L, GɃmez-Barreto D: Использование OM-85 BV у детей, страдающих рецидивирующими респираторными путями инфекции и субнормальные уровни подкласса IgG.Allergol Immunopathol (Мадр). 2003, 31: 7-13.

CAS Статья Google ученый

40.

Хайнц Б., Шлентер В.В., Кирстен Р., Нельсон К.: Клиническая эффективность Бронхо-Ваксома у взрослых пациентов с хроническим гнойным синуситом: многоцентровое плацебо-контролируемое двойное слепое исследование. Int J Clin Pharmacol Ther Toxicol. 1989, 27: 530-534.

CAS PubMed Google ученый

41.

Orcel B, Delclaux B, Baud M, Derenne JP: Оральная иммунизация бактериальными экстрактами для защиты от острого бронхита у пожилых пациентов с хроническим бронхитом, помещенных в лечебные учреждения. Eur Respir J. 7: 446-452.

42.

Cvoriscec B, Ustar M, Pardon R, Palecek I, Stipic-Markovic A, Zimic B: Пероральная иммунотерапия хронического бронхита: двойное слепое плацебо-контролируемое многоцентровое исследование. Дыхание. 1989, 55: 129-135.

CAS Статья PubMed Google ученый

43.

Macchi A, Vecchia LD: открытое сравнительное рандомизированное контролируемое клиническое исследование нового иммуностимулирующего бактериального лизата для профилактики инфекций верхних дыхательных путей. Arzneimittelforschung. 2005, 55: 276-281.

CAS PubMed Google ученый

44.

Tricarico D, Varricchio A, D’Ambrosio S, Ascione E, Motta G: Профилактика рецидивирующих инфекций верхних дыхательных путей в сообществе монахинь, находящихся в уединении, с помощью нового иммуностимулирующего бактериального лизата.Рандомизированное двойное слепое клиническое исследование. Arzneimittelforschung. 2004, 54: 57-63.

CAS PubMed Google ученый

45.

Мора Р., Барбьери М., Пассали Г.К., Соватзис А., Мора Ф., Кордоне М.П.: профилактическое средство от среднего отита у детей с инфекциями верхних дыхательных путей. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 2002, 63: 111-118.

CAS Статья PubMed Google ученый

46.

Болл П., Тиллотсон Г., Уилсон Р.: Химиотерапия хронического бронхита. Споры. Presse Med. 1995, 24: 189-194.

CAS PubMed Google ученый

47.

Никотра М., Кроненберг RS: Против: использование антибиотиков при обострениях хронического бронхита. Semin Respir Infect. 1993, 8: 254-258.

CAS PubMed Google ученый

48.

Isada CM: Pro: антибиотики при хроническом бронхите с обострениями.Semin Respir Infect. 1993, 8: 243-253.

CAS PubMed Google ученый

49.

Деббас Н., Деренн JP: Профилактические эффекты иммуностимулирующего продукта при рецидивирующих инфекциях хронического бронхита у пожилых людей. Легкое. 1990, 168 (Дополнение): 737-740.

Артикул PubMed Google ученый

50.

Колле Дж. П., Шапиро П., Эрнст П., Ренци Т., Дюкру Т., Робинсон А.: Влияние иммуностимулирующего агента на обострения и госпитализации пациентов с хронической обструктивной болезнью легких.Руководящий комитет исследования и исследовательская группа PARI-IS. Профилактика острой респираторной инфекции с помощью иммуностимулятора. Am J Respir Crit Care Med. 1997, 156: 1719-1724.

CAS Статья PubMed Google ученый

51.

Li J, Zheng J, Yuan J, Zeng G, Zhong N, Lin CY: Защитное действие бактериального экстракта против обострения у пациентов с хроническим бронхитом, сопровождающимся хронической обструктивной болезнью легких.Чин Мед Дж (англ.). 2004, 117: 828-834.

Google ученый

52.

Steurer-Stey C, Bachmann L, Steurer, Tramȳr MR: Устные очищенные бактериальные экстракты при хроническом бронхите и ХОБЛ: систематический обзор. Грудь. 2004, 126: 1645-1655.

Артикул PubMed Google ученый

53.

Cazzola M: новый бактериальный лизат защищает, уменьшая инфекционные обострения при умеренной и очень тяжелой ХОБЛ. Двойное слепое рандомизированное плацебо-контролируемое исследование.Тенденции в Мед. 2006, 6: 191-199.

Google ученый

54.

Cazzola M, Noschese P, Di Perna F: Значение добавления поливалентного механического бактериального лизата к терапии пациентов с ХОБЛ при регулярном лечении салметеролом / флутиказоном. Достижения в терапии респираторных заболеваний. 2009, 3 (2): 59-63.

Артикул Google ученый

Бактериальные лизатные препараты для респираторных заболеваний, используемые только для профилактики рецидивирующих инфекций

EMA рекомендует, чтобы бактериальные лизатные лекарства, разрешенные для респираторных заболеваний, использовались только для профилактики рецидивирующих респираторных инфекций, за исключением пневмонии.Это следует за обзором, в котором сделан вывод об отсутствии надежных данных, показывающих, что эти лекарства эффективны при лечении существующих респираторных инфекций или для профилактики пневмонии, поэтому их не следует использовать для этих целей.

В обзоре комитет EMA по лекарственным средствам для человека (CHMP) рассмотрел результаты клинических исследований, данные о побочных эффектах этих лекарств и рекомендации группы экспертов по инфекционным заболеваниям.

Хотя данные ограничены, обзор обнаружил некоторые доказательства эффективности этих лекарств в профилактике рецидивирующих инфекций дыхательных путей, а профиль безопасности соответствует тому, что ожидается для этого типа продукта.Поэтому CHMP рекомендовал продолжить использование лекарств для профилактики, но компании должны предоставить дополнительные данные о безопасности и эффективности из новых клинических исследований к 2026 году.

Информация для пациентов

• Бактериальные лизатные препараты не должны использоваться для лечить существующие инфекции дыхательных путей или предотвращать пневмонию (инфекцию легких), потому что недостаточно данных, чтобы показать, что они работают для этих целей.
• Бактериальные лизаты можно продолжать использовать для предотвращения рецидива инфекций дыхательных путей (кроме пневмонии) у пациентов, которые регулярно переносят инфекции.
• Если у вас есть инфекция и вы принимаете бактериальный лизат для ее лечения, или если вы принимаете одно из этих лекарств для предотвращения пневмонии, обратитесь к своему врачу или фармацевту за советом об альтернативных вариантах.
• Если у вас есть какие-либо вопросы или опасения по поводу вашего лекарства, обсудите их со своим врачом или фармацевтом.

Информация для медицинских работников

• Показания к применению бактериальных лизатов ограничиваются профилактикой рецидивирующих инфекций дыхательных путей, за исключением пневмонии.Бактериальные лизаты не следует назначать для лечения существующих респираторных инфекций или для профилактики пневмонии из-за отсутствия данных об эффективности.
• Информация о назначении лекарств будет обновлена ​​с новым показанием и предупреждением против использования для профилактики пневмонии.

Подробнее о лекарствах

Бактериальные лизатные лекарства производятся из бактериальных клеток, которые расщепляются и предназначены для стимуляции иммунной системы для распознавания инфекций и борьбы с ними.Эти лекарства принимают внутрь (в виде капсул, таблеток, гранул / порошка для приготовления пероральной смеси или капель), растворяют под языком (в виде таблеток), вдыхают через нос (в виде жидкости) или вводят путем инъекции в мышцу. или под кожей.

Лекарства, содержащие бактериальные лизаты, были разрешены в соответствии с национальными процедурами. Они доступны в Австрии, Бельгии, Болгарии, Чехии, Германии, Греции, Венгрии, Италии, Латвии, Литве, Люксембурге, Мальте, Польше, Португалии, Румынии, Словакии и Словении.Они продаются под несколькими торговыми марками, включая Broncho Munal, Broncho Vaxom, Buccalin, Immubron, Immucytal, Ismigen, Lantigen B, Luivac, Ommunal, Paspat, Pir-05, Polyvaccinum, Provax, Respivax и Ribomunyl.

Подробнее о процедуре

Пересмотр лекарственных средств с бактериальным лизатом был начат 28 июня 2018 года по запросу Италии в соответствии со статьей 31 Директивы 2001/83 / ЕС.

Обзор был проведен Комитетом по лекарственным средствам для человека (CHMP), отвечающим за вопросы, касающиеся лекарственных средств для человека, который принял мнение Агентства.Заключение CHMP будет направлено в Европейскую комиссию, которая примет окончательное юридически обязательное решение, применимое во всех странах-членах ЕС.

Характеристика бактериальных лизатов по Использование матричной лазерной десорбции — Ионизационная времяпролетная масс-спектрометрия Снятие отпечатков пальцев

научная статья Открытый доступ

Характеристика бактериальных лизатов с помощью Использование матричной лазерной десорбции — Ионизационная времяпролетная масс-спектрометрия Снятие отпечатков пальцев

Suarez N ^{1 *} , Ferrara F ¹ , Pirez M ² , Rial M ¹ и Chabalgoity A ¹

¹ Отдел развития биотехнологии, Институт гигиены, Медицинский факультет, Уделар, Уругвай.
² Кафедра иммунологии химического факультета, Уделар, Уругвай.

* Автор, ответственный за переписку: Норма Суарес, Отдел развития биотехнологии, Институт гигиены, Медицинский факультет, Уделар, Уругвай, тел: ++ 59824871288, факс: ++ 59824873073; Электронное письмо: @

Поступила: 17.08.2017 г .; Принята в печать: 31 августа 2017 г .; Опубликовано: 06 сентября 2017 г.

Образец цитирования: Суарес Н., Феррара Ф., Риал М., Чабалгоити А. и др. (2017) Характеристика бактериальных лизатов с помощью матричной лазерной десорбции-ионизации по времени пролета масс-спектрометрии.SOJ Biochem 3 (1): 1-7.DOI: http://dx.doi.org/10.15226/2376-4589/3/1/00124

Аннотация

Бактериальные лизаты давно используются для усиления иммунологического ответа на инфекции дыхательных путей (ИРО) как у детей, так и у взрослых. Их получают путем выращивания бактерий, обычно связанных с ИРО, с последующим химическим или механическим разрушением для получения отдельных бактериальных лизатов. которые объединены в конечном продукте.

Несмотря на широкий спектр применения, одним из недостатков их универсального использования является сложность обеспечения согласованности их состава при заданном их особая форма подготовки; Таким образом, существует потребность в альтернативных аналитических методах, обеспечивающих постоянство состава партии.

Здесь мы демонстрируем, что MALDI-TOF MS обеспечивает надежные и воспроизводимые масс-спектральные отпечатки пальцев для бактериальных лизатов S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, Staphylococcus spp . Мы также обнаружили, что механическое разрушение дает заметно более четкие отпечатки пальцев. Анализ составленного поливалентного бактериального механического лизата (PBML) также показал характерный спектр.

В целом мы обнаружили, что механический лизис в сочетании с МС-анализом позволяет точно и с высокой точностью определять ключевые белки в каждом бактериальном организме. лизат, метод, который можно использовать для стандартизации состава продукта от партии к партии.Применение этой методологии к производственному трубопроводу должно приводят к появлению более качественных продуктов, что расширяет признание этих экономичных средств для предотвращения патологий дыхательных путей.

Ключевые слова: Респираторные инфекции; бактериальные лизаты; масс-спектрометрии.

Сокращения: MALDI-TOF MS: Матричная лазерная десорбция-ионизация время пролета масс-спектрометрия Масса; ИРТ: дыхательные пути. Инфекции; PBML: поливалентный бактериальный механический лизат; PBL: поливалентные бактериальные лизаты; SDS-PAGE: полиакриламидный гель додецилсульфата натрия электрофорез; OD: оптическая плотность; TFA: трифторуксусная кислота.

Введение

Поливалентные бактериальные лизаты (PBL) широко используются десятилетиями для профилактики респираторных заболеваний [1]. Они содержат целые инактивированные микроорганизмы или определенные клеточные компоненты из разных бактериальных штаммов часто вовлечены в верхние и нижние ИРО, т.е. Staphylococcus aureus, Streptococcus viridans, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenae, Moraxella catarrhalis, Hemophylus influenzae [2].Возникновение и взлет рост числа устойчивых к антибиотикам бактерий поставил новые проблемы для бремя и эффективный контроль этих патогенов, и там потребность в новых методах лечения, которые могут ситуация. Многие инфекционные заболевания, которые когда-то легко поддавались лечению с антибиотиками в настоящее время представляют серьезную угрозу для здоровья из-за использования антибиотики могут привести к появлению еще более устойчивых инфекционных штаммов [3].

В связи с клинической значимостью респираторных инфекций и важность разработки новой иммунизации антигены, бактериальные лизаты, используемые по отдельности или в комбинации из них (поливалентные) недавно вызвали новый интерес благодаря их способность вызывать ряд эффектов на иммунную систему за счет снижения уровня колонизации [4,5].Хотя их безопасность уровни считаются приемлемыми, как и их противоинфекционные свойства, были утверждения, что более полное понимание механизма их действия, а также подробное описание их эффектов. Следовательно, обширный химический характеристика антигенов для получения высокой воспроизводимости между приготовлениями и пониманием их химические свойства могут помочь лучше понять их механизм действия и, следовательно, повышают их безопасность [2,6].

Бактериальные лизаты можно получить прогрессивным щелочным гидролиз или разрушение ячейки под высоким давлением (механическое срыв). Последнее приводит к хорошо законсервированным антигенным конструкции, избегающие денатурализации, вызванной использованием химических продуктов [7]. Есть много разных марок бактериальные лизаты, продаваемые в настоящее время, и несколько патентов описание их приготовления и их химические характеристики, которые в основном полагаются на классические лабораторные методы, такие как SDS-PAGE электрофорез, содержание белков и углеводов среди прочего [7,8,9].В настоящее время прилагаются значительные усилия для улучшения доступные методы характеристики бактериальных лизатов. В внедрение матричной лазерной десорбции / ионизации (MALDI-TOF) доказал значительный прогресс в этой области [10,11,12]. Методика позволяет получить уникальную массу подписи для каждого микроорганизма и поэтому идеально подходит для характеристика бактериальных лизатов [13]. Техника MALDI-TOF используется для производства однозарядного иона («мягкая ионизация» метод), который сохраняет целостность белков.Вкратце, аналит наносится на пластину мишени, встроенную в кристаллическую матрицу поглощает лазерную энергию. После ионизации и десорбции образца молекулы анализируются масс-анализатором (составляющая массы спектрометр) и масс-спектр образца последовательности может быть достигнуто на основе отношения молекулярной массы к заряду (m / z) [12,13,14].

Кроме того, метод позволяет быстро идентифицировать несколько бактериальных клетки, присутствующие в неизвестных клеточных суспензиях или из сложных смеси [13,14].Способность техники быстро и точно различать виды бактерий стало революция в клинической микробиологии и продемонстрировала мощность этого инструмента [15,16,17].

Тем не менее, сообщалось, что лишь небольшая часть белков, первоначально разделенных SDS PAGE, идентифицированы во время анализа MALDI TOF. Причина такого белка поведение было объяснено из-за вариации в ионизирующие свойства белков, ограниченная доступная энергия для процесса ионизации белков или наличия неионизируемых примеси [18].Однако надежность техники было продемонстрировано для широкого круга организмов [15,19,20].

Целью данной работы было объединить лизис под высоким давлением (механическое разрушение) бактерий с помощью MALDI-TOF MS методика получения спектральных белковых профилей лизатов бактерий. и разработать стандартный и воспроизводимый протокол для характеристика этих бактериальных лизатов.

В настоящее время работа в этой области сосредоточена на исследованиях. о воспроизводимости этих спектров [19].Техника может также может использоваться вместе с другими химическими и биохимическими веществами. методы обнаружения ключевых белков в сложных смесях как бактериальных лизаты, учитывая, что белки считаются наиболее надежными биомаркеры масс-спектрометрии [15,19,21].

Материалы и методы

Моновалентные бактериальные лизаты Streptococcus pneumoniae (ATCC® BAA334 ™), Haemophilus influenza (ATCC® 19418 ™), Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae (ATCC® 10031 ™) и Staphylococcus aureus subsp.aureus (ATCC® 25923 ™). для экспериментов, описанных в настоящей работе. Хартман сыворотка, неорганические соли глюкозы, аминокислоты и витамины были от Sigma – Aldrich.

MALDI матрица 3, 5-диметокси-4-гидрокси-коричная кислота (синапиновая кислота) и калибровочная стандартная смесь пептидов. приобретен в Bruker Daltonics (Биллерика, штат Массачусетс, США).

Была оценена концентрация общего белка в лизате. методом бицинхониновой кислоты [22]. Содержание углеводов оценивали методом фенол-серной кислоты и SDS-PAGE Электрофорезный анализ проводили согласно [23,24].

Среда для выращивания Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenza проводилась в стандартном подготовленная среда, содержащая: хлорид натрия (2 г / л), двухосновный фосфат натрия (2 г / л), ацетат натрия (0,5 г / л), овощи соевый пептон (40 г / л), инозин 0,1 г / л) и глюкоза (6 г / л). Обе Гемин и никотинамидадениндинуклеотид (НАДН) в финале концентрация 25 мг / мл каждая была добавлена ​​для Haemophlius influenzae культивирование. Streptococcus pneumoniae выращивали в среда определенного химического состава, о которой ранее сообщил Texeira [25].Кроме того, культивирование S. pneumoniae и H. influenzae выполняли при 37 ° C в атмосфере 5% CO ₂ .

Приготовление бактериальных лизатов

Ночные культуры каждой отдельной бактерии были выращены. в течение 12 ч при 37 ° C при 200 об / мин. Мутность была проверена и оптический Плотность (O.D) при 600 нм контролировали. Разведение 1/100 было и культуру повторно инкубировали в течение 4 часов при 37 ° C до Достигнуты значения O.D от 1,0 до 1,2. Для Haemophilus influenzae разведение после 12 ч культивирования составляло 1/50.В конце от времени культивирования бактериальную суспензию центрифугировали, после этого осадок ресуспендировали в 100 мл Hartmann сыворотки и лизис был выполнен.

Механический лизис: бактериальную суспензию (100 мл) дважды наносили на гомогенизатор EmulsiFlex-C3 с постоянной пропускная способность 3 л / час. Давление гомогенизации было регулируется в пределах от 500 до 30000 фунтов на квадратный дюйм или от 35 до 2000 бар. В поливалентные бактериальные лизаты (PMBL) получали смешиванием 250 мкг / мл белка каждого моновалентного бактериального лизата.

Анализ MALDI-TOF

Измерения MALDI-TOF проводились на Microflex. LR MALDI-TOF (Bruker Daltonics, Billerica, MS, USA) с Азотный лазер с длиной волны 337 нм, работающий в линейном режиме положительных ионов с отложенной экстракцией и оптимизирован в диапазоне m / z от 0 до 20 кДа. Калибровку проводили с калибровкой пептида. стандартная смесь (Bruker Daltonics). Лазер выстрелил 100 раз в каждое из десяти мест для каждой лунки образца на 96-луночном планшете для совокупное количество выстрелов 1000 на лунку образца, сделанных при 30% интенсивности.

На момент анализа по 1 мкл каждой бактериальной суспензии был очищен с помощью застежки-молнии, содержащей C18, и сразу после смешивания с 1 мкл матричного раствора (синапиновая кислота 10 мг / мл в стерильной H2O с 1% TFA) в соотношении 1: 1. Образец и матричную смесь наносили на 96-луночный планшет из нержавеющей стали и дали высохнуть на воздухе в течение 15 минут при комнатной температуре.

Результаты и обсуждение

Необходимо лучше охарактеризовать, стандартизировать и контролировать экстракты бактериальных лизатов, чтобы сделать их более безопасными, более эффективный и долговечный.

Поливалентные механические бактериальные лизаты (PMBL), содержащие бактериальные лизаты, полученные из штаммов патогенных бактерий, а именно Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzae, Staphyilococcus aureus и Streptococcus pneumoniae , а также каждый моновалент лизат подвергали MALDI TOF-MS анализу, чтобы идентифицировать белковые маркеры, которые будут использоваться для характеристики.

Несколько исследовательских групп продемонстрировали, что MALDI-TOF полезный метод для получения белковых профилей после клеточного экстракция и очистка [26,27,28].

В настоящей работе каждая отдельная бактерия выращивалась в специфическая питательная среда, среда на растительной основе или в случае

Фигура 1: Типичные пики высокой интенсивности масс-спектров MALDI-TOF показаны воспроизводимым образом: а) Haemophilus Influenzae бактериальный лизат, m / z 7177, 9422, 12335; б) бактериальный лизат Staphylococcus aureus , m / z 5521, 6910; в) Klebsiella pneumoniae бактериальный лизат бактерий, m / z 7332, 8614, 9135; г) Лизат бактерий Streptococcus pneumoniae, m / z 6286, 6922, 8864.

S. pneumoniae среда определенного химического состава, прошедшая фильтрацию для удаления более крупного клеточного мусора [25]. Таким образом, образующийся бактериальный лизаты содержали только растворимые молекулярные компоненты.

В качестве метода лизиса был выбран механический лизис бактерий. клетки, потому что он имеет преимущество в сохранении антигенных структура, в отличие от химических методов, таких как щелочной лизис которые вызывают изменения в структуре белка [29]. Все лизаты (индивидуальные или поливалентные) антигенные паттерны анализировали с помощью SDS-гель-электрофорез, содержание белков и углеводов и масс-спектрометрия.Матрица, выбранная для идентификации белками бактериальных лизатов была синапиновая кислота (SA), одна из наиболее часто используемые органические матрицы, которые продемонстрировали для обеспечения эффективной ионизации белков лизатов бактерий [30]. Полученные спектральные картины были оценены на основе уровня сигнала, разрешения и воспроизводимости. Эти критерии все они необходимы для эффективного снятия отпечатков пальцев [19,28].

На рис. 1a, b, c и d показаны типичные спектральные отпечатки пальцев. из Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae и Klebsiella pneumoniae с помощью MALDI-TOF MS.В отдельные наблюдаемые профили спектров являются результатом механического нарушение, которое способствует сохранению структуры белка, который могут использоваться как идеальные маркеры для характеристики. Сигналы в диапазоне от 4000 до 20000 Да были ранее относится к высококлеточным консервативным белкам домашнего хозяйства или белки, ассоциированные с клеточной стенкой и, следовательно, используемые как белковые маркеры для идентификации видов бактерий [19]. Кроме того, Кришнамурти и его сотрудники сообщили который разрушает интактные клетки, смешанный с синапиновой кислотой (MALDI матрица) и подверглись прямой лазерной десорбции с помощью матрицы ионизационный анализ (MALDI-MS) высвободил биомаркеры в большей численность и укажите их молекулярные массы [28].Протеин информация о паттернах генерируется быстро, и методика явные преимущества перед трудоемкой техникой SDS-PAGE.

В текущих условиях эксперимента наиболее спектральная наблюдаемые пики находились в диапазоне масс m / z 5000-12000 Да. На рис. 1а показаны Haemophilus influenzae три возможных биомаркеры сосредоточены примерно на m / z 7181, 9123 и 12336 соответственно с высокой интенсивностью воспроизводимым образом. Хагг, и другие. сообщили об использовании MALDI / TOF-MS в качестве метода для быстрая идентификация и видообразование Haemophilus influenzae [31].Масс-спектральные отпечатки пальцев, сообщенные авторами различаются между целыми клетками и лизированными. В В настоящей работе значения белка m / z совпадают, но не идентичны найденным авторами значениям белка m / z для их лизаты, возможное объяснение различий могло быть связано с используемым методом лизиса [31]. Кроме того, в нашем экспериментов мы обнаружили согласованность в образцах, полученных из три независимых выращенных образца, предполагая, что спектр МС профиль Haemophilus influenzae воспроизводимый, надежный и таким образом, может быть полезно для целей характеристики.

В случае Staphylococcus aureus Рисунок 1 b два пика с центром около m / z 5500 и 7000 показали высокую интенсивность, результат аналогичен тому, что сообщили Бернардо и его коллеги, которые сообщили о двух конкретных пиках m / z 5500 и m / z 7000 для S. aureus бактериальный лизат, полученный методом MALDI TOF MS в режиме рефлектора [32]. Другое исследование показало, что девять из клинических изолятов S. aureus общие значения m / z очень близки к значениям m / z, найденным Бернардо [33].В настоящей работе эти результаты были воспроизведены для S. aureus, подтверждающие идею о том, что эти белки могут использоваться в качестве биомаркеров для характеристики бактериальных лизатов.

На рис. 1с показан профиль белка Klebsiella pneumoniae . Klebsiella pneumoniae бактериальный лизат показал надежный белок точность рисунка с m / z 7332, m / z 8621 и m / z 9142. Все три пика ранее были обнаружены в Klebsiella pneumonia клинические изоляты [33].В этом исследовании сообщалось о стабильных спектры отпечатков пальцев для Klebsiella pneumoniae и еще несколько пиков белков, чем наблюдаемые здесь, разница может быть объяснены проведенной процедурой экстракции или эффективность протонизации белков.

Бактериальный лизат Streptococcus pneumoniae Рисунок 1 d породил ионы около m / z 6200, m / z 6900 и m / z 8800 в масс-спектрах MALDI-TOF. К сожалению, их не так много сообщения в литературе с использованием S.pneumoniae механически разрушенные лизаты для анализа MALDI, для сравнения с образец белка, найденный здесь. Однако есть несколько групп в котором использовались модифицированные подходы к пробоподготовке S. pneumoniae для исследования дифференциации видов [34]. Получение спектра бактериального лизата S pneumoniae представленные здесь последовательно показали наличие трех пиков который оказался специфичным для используемого штамма.

Одним из факторов, влияющих на получаемые спектры, является воспроизводимость.Некоторые авторы ранее сообщили, что воспроизводимость зависит от стандартизации MALDI-TOF для экспериментальных такие условия, как использованная матрица, соотношение выборка: матрица, питательная среда и условия роста среди прочего, хотя другие исследования показали, что часть пиков сохраняется в спектрах, полученных несмотря на разные экспериментальные условия [33,35]. Картина спектров, полученная в настоящей работе для все штаммы показали высокую воспроизводимость. Как показано в Рисунок 2, масс-спектральное сравнение реплик Klebsiella pneumoniae , выращенных в одинаковых условиях в разные дни проявляет высокую степень сходства, формирует стабильный спектр и предоставили доказательства того, что эти белковые сигналы могут служить маркеры подписи, как сообщалось ранее [19,28].

Кроме того, эти рибосомные белки хорошо представлены и может объяснить возможность использования MALDI-TOF для бактериального идентификация и характеристика бактериальных лизатов даже без стандартизация экспериментальных условий. Однако это стоит подчеркнуть, что для оптимизации воспроизводимости Следует установить стандартизацию пробоподготовки.

О сравнении и анализе результатов МАЛДИТОФ МС с использованием стандартных методов SDSPAGE На рисунке 3 было замечено большее количество белков, чем соответствующая картина спектров MALDI, противоречивые результаты можно объяснить недостаточностью переноса протона.Ион подавление может возникать из-за примесей, которые менее ионизируются такие как соли, которые могут повлиять на количество заряженных ионов, попадающих детектор [18]. Небольшой наконечник пипетки «Zip-Tip» с обратной стороной

Рисунок 2: MALDI-TOF MS-спектры Klebsiella pneumoniae, демонстрирующие воспроизводимость спектров. Каждый спектр представляет собой независимо созданный набор данных для свежеприготовленных бактериальных лизатов.

Фигура 3: Типичный образец бактериальных лизатов SDS-PAGE.SDS-PAGE анализ механически приготовленных бактериальных лизатов. 1) S. aureus бактериальный лизат 2) S. pneumoniae бактериальный лизат 3) K. pneumoniae бактериальный лизат 4) H. influenzae бактериальный лизат. 5) Стандарт термобелка Молекулярный вес 5-250 кДа

фазовые сорбенты (C18) использовались для преодоления этого частичного ионизационного подавление и улучшение полученных отпечатков пальцев.

На Фигуре 4 представлен белковый профиль механически поливалентного показан бактериальный лизат.Прибор обнаружил 89 белков. пики в диапазоне m / z 4000 и 20000, из которых наиболее выдающиеся были примерно на m / z 7360, m / z 8800, m / z 9540 и m / z 12340. Замечательная воспроизводимость метода позволили измерить белки, стабильно экспрессируемые в высокий уровень численности, и эти биомаркеры можно использовать для характеристика бактериальных лизатов.

Для расширения характеристик бактериального лизата оба белка и содержание углеводов.Средний белок и содержание углеводов для всех бактериальных лизатов было в диапазон от 0,5 ± 0,019 мг / мл до 1,3 ± 0,019 мг / мл для белка и от 0,4 до 0,5 мг / мл для углеводов соответственно. Эти значения согласуются с приведенными в литературе, в основном в патентах, в которых ранее сообщалось о препаратах и характеристика бактериальных лизатов [7,8,36].

Выводы

MALDI-TOF MS анализ бактериальных лизатов предоставил уникальные спектральные диаграммы для одновалентных, а также поливалентных бактериальных лизаты с высокой воспроизводимостью.Эти характерные отпечатки пальцев таким образом можно использовать для обеспечения согласованности и воспроизводимости производство бактериального лизата. Механическое нарушение бактериального клетки с использованием лизиса под высоким давлением, что привело к более точному определению отпечатки пальцев по сравнению с отпечатками пальцев MS, полученными от лизаты, полученные щелочным лизисом, что позволяет предположить, что механический нарушение лучше сохраняет структуру белка в препарате. Анализ

MALDI-TOF MS простой, быстрый и экономичный, поэтому описанная методология показала большой потенциал для использования как дополнительный инструмент для характеристики бактериального лизата.Это следует дополнительно изучить для достижения стандартных и воспроизводимых протоколы производства бактериальных лизатов, важный шаг в контроль качества конечного продукта.

Благодарность

Работа частично профинансирована Национальным агентством. исследований и инноваций (ANII, Уругвай) и PEDECIBAQuímica, Уругвай. Мы хотели бы поблагодарить Lic. Араси Мартинес для ее техническая помощь. Мы в долгу перед доктором Валери Ди за нее ценная переработка этой работы.

Рисунок 4: Типичные спектры MALDI-TOF поливалентного механического бактериального лизата (PMBL).
MALDI-TOF масс-спектры поливалентного механического бактериального лизата (PMBL), показывающие четыре выдающихся пика около m / z 7360, m / z 8800, m / z 9540 и m / z 12340.

1. Braido F, Schenone G, Pallestrini E, Reggiardo G, Cangemi G, Canonica GW и др. Взаимосвязь между иммунным ответом слизистой оболочки и клиническим исходом у пациентов с рецидивирующими инфекциями верхних дыхательных путей, леченных механическим бактериальным лизатом. J Biol Regul Homeost Agents. 2011; 25 (3): 477-485.
.
2. Cazzola M, Capuano A, Rogliani P, Matera MG.Бактериальные лизаты как потенциально эффективный подход к профилактике обострения ХОБЛ. Curr Opin Pharmacol. 2012. 12 (3): 300–308. DOI: 10.1016 / j.coph.2012.01.019
3. Фаулер Т., Уокер Д., Дэвис, СК. Риск / польза от предсказания постантибиотической эры: работает ли сигнал тревоги? Ann N Y Acad Sci. 2014; 1323: 1–10. DOI: 10.1111 / nyas.12399
4. Rial A, Ferrara F, Suárez N, Scavone P, Marqués JM, Chabalgoity JA. Интраназальное введение поливалентного бактериального лизата вызывает саморегулирующееся воспаление в легких и сигнатуру памяти Th2 / Th27.Микробы заражают. 2016; 18 (12): 747–757. DOI: 10.1016 / j.micinf.2016.10.006
5. Braido F, Melioli G, Candoli P, Cavalot A, Di Gioacchino M, Ferrero V и др. Бактериальный лизат Lantigen B снижает количество острых эпизодов у пациентов с рецидивирующими инфекциями дыхательных путей: результаты двойного слепого многоцентрового плацебо-контролируемого клинического исследования. Immunol Lett. 2014; 162 (2 Pt B): 185–193. DOI: 10.1016 / j.imlet.2014.10.026
6. Rozy A, Chorostowska-Wynimko J.Бактериальные иммуностимуляторы — механизм действия и клиническое применение при респираторных заболеваниях. Пневмонол Алергол Пол. 2008. 76 (5): 353–359.
7. Bauer J, Hirt P, Schulthess A. Экстракт бактериальных макромолекул, способ его получения и фармацевтическая композиция, содержащая его. 1995; US5424287 A.
8. Bauer JA, Salvagni M, Vigroox J-PL, Chalvet L, Chiavaroli C. Бактериальный экстракт для респираторных заболеваний и способ его приготовления. 2010; США 2010/0227013 A1.
   
9. Пиллич Дж., Балкарек Дж. С. Составы и методы лечения микробных инфекций. US8
   5 B2 2014.
10. Lay JO Jr. MALDI-TOF масс-спектрометрия бактерий. Масс-спектром. Rev.2001; 20 (4): 172–194. DOI: 10.1002 / mas.10003
11. Рыжов В., Фенселау С. Характеристика подмножества белков, десорбированных MALDI из целых бактериальных клеток. Anal Chem. 2001. 73 (4): 746–750.
12. Singhal N, Kumar M, Kanaujia PK, Virdi JS.Масс-спектрометрия MALDI-TOF: новая технология для идентификации и диагностики микробов. Front Microbiol. 2015; 6: 791. DOI: 10.3389 / fmicb.2015.00791
13. Liang X, Zheng K, Qian MG, Lubman DM. Определение профилей бактериальных белков с помощью матричной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии с высокоэффективной жидкостной хроматографией. Масс-спектр Rapid Commun. 1996. 10 (10): 1219–1226.
14. Pineda FJ, Lin JS, Fenselau C, Demirev PA. Проверка значимости идентификации микроорганизмов с помощью масс-спектрометрии и поиска в базе данных протеомов.Anal Chem. 2000. 72 (16): 3739–3744.
15. Демирев П.А., Фенселау К. Масс-спектрометрия для быстрой характеристики микроорганизмов. Annu Rev Anal Chem. 2008; 1: 71–93.
16. Карими А., Аманати А. Матричная лазерная десорбция / ионизационная времяпролетная масс-спектрометрия: новое руководство по инфекционным заболеваниям. Arch Pediatr Infect Dis. 2016; 4 (2): e31816.
17. Hrabák J, Chudácková E, Walková R. Матричная лазерная десорбционная ионизация-времяпролетная масс-спектрометрия для определения механизмов устойчивости к антибиотикам: от исследования до рутинной диагностики.Clin Microbiol Rev.2013; 26 (1): 103–114. DOI: 10.1128 / CMR.00058-12
18. Аннесли TM. Подавление ионов в масс-спектрометрии. Clin Chem. 2003. 49 (7): 1041–1044.
19. Fenselau CC. Быстрая характеристика микроорганизмов с помощью масс-спектрометрии — что можно узнать и как? J Am Soc масс-спектрометрия. 2013. 24 (8): 1161–1166. DOI: 10.1007 / s13361-013-0660-7
20. Qian J, Cutler JE, Cole RB, Cai Y. Массовые сигнатуры MALDI-TOF для дифференциации видов дрожжей, группировки штаммов и мониторинга маркеров морфогенеза.Anal Bioanal Chem. 2008. 392 (3): 439–449. DOI: 10.1007 / s00216-008-2288-1
21. Мюррей PR. Что нового в клинической микробиологии — идентификация микробов с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF: доклад с симпозиума больницы Уильяма Бомонта 2011 года по молекулярной патологии. J Mol Diagn. 2012. 14 (5): 419–423. DOI: 10.1016 / j.jmoldx.2012.03.007
22. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano MD, et al. Измерение белка с использованием бицинхониновой кислоты. Анальная биохимия.1985. 150 (1): 76–85.
23. Куэста Г., Суарес Н., Бессио М.И., Феррейра Ф., Массальди Х. Количественное определение пневмококкового капсульного полисахарида серотипа 14 с использованием модификации фенол-сернокислотного метода. J Microbiol Methods. 2003. 52 (1): 69–73.
24. Laemmli UK. Расщепление структурных белков при сборке головки бактериофага Т4. Природа. 1970. 227 (5259): 680–685.
25. Texeira E, Checa J, Ríal A, Chabalgoity JA, Suárez N. Новая среда определенного химического состава для культивирования Streptococcus pneumoniae серотипа 1.Журнал биотехнологических исследований. 2015; 6: 54–62.
26. Croxatto A, Prod’hom G, Greub G. Применение масс-спектрометрии MALDI-TOF в клинической диагностической микробиологии. FEMS Microbiol Rev.2012; 36 (2): 380–407. DOI: 10.1111 / j.1574-6976.2011.00298
27. Сантос С., Патерсон Р.Р., Венансио А., Лима Н. Характеристики мицелиальных грибов с помощью матричной лазерной десорбции / ионизации-времяпролетной масс-спектрометрии. J Appl Microbiol. 2010. 108 (2): 375–385. DOI: 10.1111 / j.1365-2672.2009.04448
28. Кришнамурти Т., Раджамани Ю., Росс П.Л., Джаббор Р., Наир Х., Энг Дж. И др.Масс-спектральные исследования микроорганизмов. Toxin Rev.2000; 19: 95–117.
29. Islam MS, Aryasomayajula A, Selvaganapathy PR. Обзор методов макро- и микромасштабного лизиса клеток. Микромашины. 2017; 8 (3): 83. DOI: 10.3390 / mi8030083
30. Fagerquist CK, Garbus BR, Williams KE, Bates AH, Harden LA. Ковалентное присоединение и диссоциативная потеря синапиновой кислоты в / из цистеин-содержащих белков из лизатов бактериальных клеток, проанализированных с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF-TOF. J Am Soc масс-спектрометрия.2010. 21 (5): 819–832. DOI: 10.1016 / j.jasms.2010.01.013
31. Haag AM, Taylor SN, Johnston KH, Cole RB. Быстрая идентификация и видообразование бактерий Haemophilus с помощью матричной лазерной десорбции / ионизации времяпролетной масс-спектрометрии. J. Mass Spectrom. 1998. 33 (8): 750–756.
32. Бернардо К., Пакулат Н., Махт М., Крут О, Зейферт Н., Флир С. и др. Идентификация и дискриминация штаммов Staphylococcus aureus с использованием матричной лазерной десорбции / ионизации-времяпролетной масс-спектрометрии.Протеомика. 2002. 2 (6): 747–753.
33. Panda A, Kurapati S, Samantaray JC, Srinivasan A, Khalil S. Идентификация клинических бактериальных изолятов на основе масс-спектрометрии MALDI-TOF и протеомной идентификации. Индийский J Med Res. 2014. 140 (6): 770–777.
34. Верно AM, Кристнер М, Андерсон Т.П., Мердок ДР. Дифференциация Streptococcus pneumoniae от непневмококковых стрептококков группы Streptococcus mitis с помощью матричной лазерной десорбционной ионизации — времяпролетная масс-спектрометрия.

    No related posts.